bann metabolit iminomodulater i en karakteristik kle dan mikrolanvironnman timer (TME), me avek detrwa leksepsyon, zot lidantite i reste an gran parti enkoni. La, nou'n analiz bann timer ek bann selil T sorti dan bann timer ek asit bann pasyan avek karsinoma seroz o-grad (HGSC) pou revel metabolom sa bann diferan konpartiman TME. asit ek bann selil timer i annan bann diferans metabolit ekstansiv. konpare avek ascites, bann selil T ki enfiltre dan timer i ganny anrisir dan 1-methylnicotinamide (MNA). Malgre ki nivo MNA dan bann selil T i eleve, lekspresyon nicotinamide N-methyltransferase (en lanzim ki kataliz transfer bann group metil sorti S-adenosylmethionine pour al dan nicotinamide) i limite avek bann fibroblast ek bann selil timer. Fonksyonnelman, MNA i ensit bann selil T pou sekrete sa sitokin ki promot timer fakter nekroz timer alfa. Alor, MNA ki sorti dan TME i kontribye dan regilasyon iminiter bann selil T e i reprezant en target iminoterapi potansyel pou tretman kanser imen.
bann metabolit ki sorti dan timer i kapab annan en lefe inibiter profon lo iminite anti-timer, e deplizanpli levidans i montre ki zot kapab osi servi koman en lafors kle pou progresyon maladi (1). an plis ki lefe Warburg, bann travay resan in konmans karakteriz leta metabolik bann selil timer e son relasyon avek leta iminiter mikrolanvironnman timer (TME). bann letid lo bann model sourit ek bann selil T imen in montre ki metabolism glutamine (2), metabolism oksidativ (3) e metabolism glikoz (4) i kapab azir endepandaman lo diferan sou group selil iminiter. plizyer metabolit dan sa bann semen i anpes fonksyon anti-tumor bann selil T. in ganny prouve ki blokaz koanzim tetrahydrobiopterin (BH4) i kapab andomaz proliferasyon bann selil T, e logmantasyon BH4 dan lekor i kapab amelyor larepons iminiter anti-tumor medyate par CD4 ek CD8. an plis, lefe imunosupresif kynurenine i kapab ganny sove par ladministrasyon BH4 (5). dan isocitrate dehydrogenase (IDH) glioblastoma mutan, sekresyon enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) i anpes aktivasyon selil T, proliferasyon e aktivite sitoliz (6). resaman, in ganny demontre ki methylglyoxal, en by-product glycolysis, i ganny prodwir par bann selil sipreser lorizin myeloid, e transfer selil T methylglyoxal i kapab enhibit fonksyon selil T efekter. dan tretman, netralizasyon methylglyoxal i kapab sirmont aktivite bann selil sipreser ki sorti dan myeloid (MDSC) e sinerzistikman amelyor terapi blokaz checkpoint dan bann model sourit (7). Sa bann letid i kolektivman met lanfaz lo rol kle bann metabolit ki sorti dan TME dan regilasyon fonksyon ek aktivite T cell.
disfonksyonnman selil T in ganny raporte dan kanser ovari (8). Sa i an parti akoz bann karakteristik metabolik ki eneren dan ipoksi ek vaskilatir timwar abnormal (9), ki an rezilta i konversyon glikoz ek triptofan dan bann prodwi segonder tel ki lasid laktik ek kynurenine. laktat ekstraselilyer an ekse i redwir prodiksyon interferon-γ (IFN-γ) e i anmenn diferansyasyon bann sou group myelosuppressive (10, 11). konsomasyon tryptophan i direkteman anpes proliferasyon selil T e anpes sinyal resepter selil T (12-14). Malgre sa bann lobzervasyon, en kantite travay otour metabolism iminiter ti ganny fer dan kiltir selil T in vitro an servan medya optimize, oubyen limite a bann model sourit omolog in vivo, ni enn ni lot pa reflekte konpletman eterozenite bann kanser imen e lanvironnman makro e mikro fizyolozik.
en karakteristik komen kanser ovari se propagasyon peritoneal e laparans asit. akimilasyon likid selil dan asit i asosye avek maladi avanse e move pronostik (15). dapre bann rapor, sa konpartiman inik i ipoksik, i annan o nivo fakter krwasans endotelyal vaskiler (VEGF) e indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), e i ganny enfiltre par bann selil regilatwar T e bann selil inibiter myeloid (15-18). lanvironnman metabolik ascites i kapab diferan avek sa timer limenm, alor reprogramasyon bann selil T dan lespas peritoneal i pa kler. an plis, bann diferans kle e eterozenite ant ascites ek metabolit prezan dan lanvironnman timer i kapab anpes lenfiltrasyon bann selil iminiter e zot fonksyon lo bann timer, e plis resers i neseser.
Pou rezourd sa bann problenm, nou'n konsevwar en metod separasyon selil sansib e kromatografi likid tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) pou etidye diferan kalite selil (enkli CD4 + e CD8 + T cells) osi byen ki dan e ant bann timer Son bann metabolit i kouver bann selil dan menm lanvironnman asit ek timer pasyan. nou servi sa metod an konzwentman avek flow cytometry o dimansyonnel e sekansman RNA selil tousel (scRNA-seq) pou donn en portre tre rezourd lo stati metabolik sa bann popilasyon kle. Sa metod in revel en logmantasyon enportan dan nivo 1-methylnicotinamide (MNA) dan bann selil T timer, e bann eksperimantasyon in vitro in montre ki lefe iminomodulater MNA lo fonksyon selil T ti enkoni oparavan. an zeneral, sa metod i revel bann enteraksyon metabolik mityel ant bann timer ek bann selil iminiter, e i donn bann apersi inik lo bann metabolit regilasyon iminiter, ki kapab itil pou tretman bann loportinite tretman iminoterapi kanser ovari baze lo selil T.
nou ti servi flow cytometry o dimansyonnel pou kantifye absorpsyon glikoz anmenmtan [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) e aktivite mitokondriyal [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (2017, 2019) i lo kote bann marker tipik ki fer distenksyon ant bann selil iminiter ek popilasyon bann selil timer (latab S2 ek figir S1A). sa analiz in montre ki konpare avek bann selil T, bann selil ascites ek timer i annan en pli o nivo absorpsyon glikoz, me i annan bann diferans pli pti dan aktivite mitokondriyal. absorpsyon mwayenn glikoz dan bann selil timer [CD45-EpCAM (EpCAM)+] i trwa a kat fwa sa ki pour bann selil T, e absorpsyon mwayenn glikoz dan bann selil T CD4 + i 1.2 fwa sa ki pour bann selil CD8 + T, ki endike ki bann lenfosit enfiltrasyon timer (TIL) i annan diferan legzizans metabolik menm dan menm figir TAME (Figure 1). par kont, aktivite mitokondriyal dan bann selil timer i parey pour bann selil CD4 + T, e aktivite mitokondriyal tou le de kalite selil i pli o ki pour bann selil CD8 + T (Figure 1B). an zeneral, sa bann rezilta i revel nivo metabolik. aktivite metabolik bann selil timer i pli o ki pour bann selil CD4 + T, e aktivite metabolik bann selil CD4 + T i pli o ki pour bann selil CD8 + T. Malgre sa bann lefe atraver bann kalite selil, napa okenn diferans konsistan dan stati metabolik bann selil CD4 + ek CD8 + T oubyen zot proporsyon relatif dan ascites konpare avek bann timer (Figure 1C). par kont, dan fraksyon selil CD45, proporsyon bann selil EpCAM+ dan timer ti ogmante konpare avek ascites (Figure 1D). nou ti osi obzerv en diferans metabolik kler ant bann konponan selil EpCAM+ ek EpCAM-. bann selil EpCAM+ (timer) i annan en pli o absorpsyon glikoz e aktivite mitokondriyal ki bann selil EpCAM-, ki bokou pli o ki aktivite metabolik bann fibroblast dan bann selil timer dan TME (Figure 1, E ek F).
(A ek B) lentansite fluoresans medyan (MFI) absorpsyon glikoz (2-NBDG) (A) e aktivite mitokondriyal bann selil CD4 + T (MitoTracker rouz fonse) (B) bann graf reprezantatif (gos) e lenformasyon tabule (drwat), bann selil CD8 + T e bann selil EpCAM + CD45-tumor sorti dan bann selil timer ek timer ek bann timer. (C) Rapor bann selil CD4 + ek CD8 + (dan bann selil T CD3 +) dan ascites ek timer. (D) Proporsyon bann selil timer EpCAM + dan ascites ek timer (CD45−). (E ek F) EpCAM + CD45-tumor ek EpCAM-CD45-matrix glikoz uptake (2-NBDG) (E) ek aktivite mitokondriyal (MitoTracker rouz fonse) (F) bann graf reprezantatif (gos) ek lenformasyon tabule (Drwat) Ascites ek bann selil timer. (G) bann graf reprezantatif lekspresyon CD25, CD137 ek PD1 par flow cytometry. (H ek I) lekspresyon CD25, CD137 ek PD1 lo bann selil CD4 + T (H) ek bann selil T CD8 + (I). (J ek K) Fenotip naif, memwar santral (Tcm), efekter (Teff) ek memwar efekter (Tem) baze lo lekspresyon CCR7 ek CD45RO. bann zimaz reprezantatif (gos) ek lenformasyon tabular (drwat) bann selil CD4 + T (J) ek bann selil CD8 + T (K) dan ascites ek timer. bann valer P determinen par t-test an per (*P<0.05, **P<0.01 e ***P<0.001). sa laliny i reprezant bann pasyan ki'n ganny matche (n = 6). FMO, floresans mwens enn; MFI, lentansite fluoresans medyan.
plis analiz in revel lezot diferans enportan ant stati fenotip selil T tre rezourd. Memwar aktive (Figure 1, G to I) ek efekter (Figure 1, J ek K) dan bann timer i bokou pli frekan ki ascites (proporsyon bann selil CD3 + T). Pareyman, analiz fenotip par lekspresyon bann marker aktivasyon (CD25 ek CD137) e bann marker deplesyon [protein lanmor selil progranmen 1 (PD1)] ti montre ki malgre ki bann karakteristik metabolik sa bann popilasyon i diferan (Figure S1, B ziska E), Me napa okenn diferans metabolik enportan ki ti ganny obzerve konstaman ant bann lefe memwar naif, oubyen sou-set (Figure S1, S1) MWAN). Sa bann rezilta ti ganny konfirmen par servi bann metod laprantisaz masin pou otomatikman donn bann fenotip selil (21), ki ti osi revel prezans en gran nonm selil lanmwal lezo (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) dan ascites pasyan (Figure S2A ). parmi tou bann kalite selil idantifye, sa popilasyon selil myeloid ti montre pli o absorpsyon glikoz e aktivite mitokondriyal (Figure S2, B ziska G). Sa bann rezilta i fer resorti bann diferans metabolik for ant bann miltip kalite selil ki ganny trouve dan ascites ek timer dan bann pasyan HGSC.
Defi prensipal dan konpran bann karakteristik metabolomik TIL se nesesite pou izol bann lesantiyon T cell avek ase pirte, kalite e kantite sorti dan bann timer. bann letid resan in montre ki bann metod triyaz ek lanrisisman perl baze lo flow cytometry i kapab anmenn bann sanzman dan bann profil metabolit seliler (22-24). pou sirmont sa problenm, nou'n optimiz metod lanrisisman perl pou izol e izol TIL avek kanser ovari imen ki'n ganny retire par loperasyon avan analiz par LC-MS/MS (vwar Materyo ek Metod; Fig 2A). Pour kapab evalye lenpak zeneral sa protokol lo bann sanzman metabolit, nou ti konpar bann profil metabolit bann selil T ki ti ganny aktive par bann donater an bonn sante apre sa letap separasyon perl anler avek bann selil ki pa ti ganny separe par perl me ki ti reste lo ice. Sa analiz kontrol kalite in trouve ki i annan en o korelasyon ant sa de kondisyon (r = 0.77), e repetabilite teknik sa group 86 metabolit i annan en repetabilite o (Figure 2B). Alor, sa bann metod i kapab fer en analiz metabolit presi dan bann selil ki pe fer lanrisisman kalite selil, e alor fourni premye platform o rezolisyon pou idantifye bann metabolit spesifik dan HGSC, e alor permet dimoun ganny en konprenezon pli profon lo spesifisite selil Progranm metabolism seksyel.
(A) dyagram skematik lanrisisman perl magnetik. avan analiz par LC-MS/MS, bann selil pou pas atraver trwa tour konsekitiv lanrisisman perl magnetik oubyen reste lo ice. (B) Lefe kalite lanrisisman lo labondans bann metabolit. mwayenn trwa mezir pou sak kalite lanrisisman ± SE. sa laliny gri i reprezant en relasyon 1:1. korelasyon ant laklas (ICC) bann mezir repete ki ganny montre dan label laks. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) dyagram skematik workflow analiz metabolit pasyan. bann asit oubyen bann timer i ganny kolekte avek pasyan e krioprezerve. En pti porsyon sak lesantiyon ti ganny analize par flow cytometry, tandis ki larestan bann lesantiyon ti pas atraver trwa tour lanrisisman pour bann selil CD4+, CD8+ e CD45-. sa bann fraksyon selil ti ganny analize an servan LC-MS/MS. (D) Map lasaler labondans metabolit standarize. sa dendrogram i reprezant groupman Ward bann zistans Euclidean ant bann lesantiyon. (E) Analiz konponan prensipal (PCA) lo map metabolit lesantiyon, ki montre trwa replika sak lesantiyon, bann lesantiyon sorti kot menm pasyan i ganny konekte par en laliny. (F) PCA profil metabolit sa lesantiyon kondisyonnen lo pasyan (ie, an servan redondans parsyel); kalite lesantiyon i limite par lakok konveks. PC1, konponan prensipal 1; PC2, konponan prensipal 2.
apre, nou ti aplik sa metod lanrisisman pou analiz 99 metabolit dan bann fraksyon CD4 +, CD8 + e CD45-selil dan bann asit ek timer primer sis pasyan HGSC (Figure 2C, Figure S3A e latab S3 ek S4). popilasyon lentere i reprezant 2% a 70% sa gran lesantiyon orizinal bann selil vivan, e proporsyon bann selil i varye bokou ant pasyan. Apre ki in separ bann perl, sa fraksyon lentere anrisir (CD4+, CD8+ ou CD45-) i reprezant plis ki 85% tou bann selil vivan dan sa lesantiyon an mwayenn. sa metod lanrisisman i permet nou analiz bann popilasyon selil sorti dan metabolism tisi timer imen, ki enposib pou fer avek bann gran lesantiyon. An servan sa protokol, nou'n determinen ki l-kynurenine ek adenosine, sa de metabolit imunosupresiv byen karakterize ti ganny eleve dan bann selil T timer oubyen bann selil timer (Figure S3, B ek C). Alor, sa bann rezilta i demontre fidelite ek abilite nou teknolozi separasyon selil ek spektrometri mas pou trouv bann metabolit biolozikman enportan dan bann tisi pasyan.
nou analiz in osi revel en separasyon metabolik for bann kalite selil dan e ant pasyan (Figure 2D ek Figure S4A). An partikilye, konpare avek lezot pasyan, pasyan 70 ti montre diferan karakteristik metabolik (Figure 2E ek Figure S4B), ki endike ki i kapab annan en eterozenite metabolik sibstansyel ant bann pasyan. I bon note ki konpare avek lezot pasyan (1.2 a 2 lit; latab S1), lakantite total ascites ki ti ganny kolekte dan pasyan 70 (80 ml) ti pli pti. Kontrol eterozenite ant pasyan pandan analiz konponan prensipal (par egzanp, an servan analiz redondans parsyel) i montre bann sanzman konsistan ant bann kalite selil, e bann kalite selil e/oubyen mikrolanvironnman i ganny klerman agrege dapre profil metabolit (Figure 2F ). analiz bann metabolit tousel ti met lanfaz lo sa bann lefe e ti revel bann diferans enportan ant bann kalite selil ek mikrolanvironnman. I bon note ki diferans pli ekstrenm ki ganny obzerve se MNA, ki normalman ganny anrisir dan bann selil CD45- e dan bann selil CD4+ ek CD8+ ki enfiltre dan timer (Figure 3A). Pour bann selil CD4 +, sa lefe i pli evidan, e MNA dan bann selil CD8 + i osi paret ganny fortman afekte par lanvironnman. Sepandan, sa pa enportan, akoz zis trwa dan sa sis pasyan ki kapab ganny evalye pou bann skor CD8+ timer. An plis ki MNA, dan diferan kalite selil dan asit ek timer, lezot metabolit ki mal karakterize dan TIL i osi diferansyelman ris (Zis S3 ek S4). Alor, sa bann lenformasyon i revel en set prometan bann metabolit iminomodulater pou plis resers.
(A) Konteni normalize MNA dan CD4+, CD8+ e CD45- bann selil sorti dan ascites ek timer. sa box plot i montre medyan (laliny), ranze enterkartil (charnier kad) e ranze lenformasyon, ziska 1.5 fwa ranze enterkartil (moustas kad). parey in ganny dekrir dan materyo ek metod pasyan, servi valer limma pasyan pou determin valer P (*P<0.05 e **P<0.01). (B) dyagram skematik metabolism MNA (60). metabolit: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. bann lanzim (ver): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE of scRNA-seq of ascites (gri) ek timer (rouz; n = 3 pasyan). (D) lekspresyon NNMT dan diferan popilasyon selil idantifye an servan scRNA-seq. (E) Lekspresyon NNMT ek AOX1 dan SK-OV-3, ronnyon anbriyon imen (HEK) 293T, bann selil T e bann selil T trete avek MNA. lekspresyon pliye i ganny montre par rapor avek SK-OV-3. patern lekspresyon avek SEM i ganny montre (n = 6 donater an bonn sante). bann valer Ct plis ki 35 i ganny konsidere koman endetektab (UD). (F) Lekspresyon SLC22A1 ek SLC22A2 dan SK-OV-3, HEK293T, bann selil T ek bann selil T trete avek 8mM MNA. lekspresyon pliye i ganny montre par rapor avek SK-OV-3. patern lekspresyon avek SEM i ganny montre (n = 6 donater an bonn sante). bann valer Ct plis ki 35 i ganny konsidere koman endetektab (UD). (G) Konteni MNA selil dan bann selil T donater an bonn sante ki'n ganny aktive apre 72 erdtan enkubasyon avek MNA. patern lekspresyon avek SEM i ganny montre (n = 4 donater an bonn sante).
MNA i ganny prodwir par transfer group methyl sorti S-adenosyl-1-methionine (SAM) pour al nicotinamide (NA) par nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figure 3B). NNMT i ganny eksprimen dan en varyete kanser imen e i asosye avek proliferasyon, lenvazyon e metastaz (25-27). pou pli byen konpran sours MNA dan bann selil T dan TME, nou ti servi scRNA-seq pou karakteriz lekspresyon NNMT atraver bann kalite selil dan ascites ek timer trwa pasyan HGSC (Tab S5). analiz lo apepre 6,500 selil ti montre ki dan bann lanvironnman asit ek timer, lekspresyon NNMT ti restrikte a bann popilasyon fibroblast ek selil timer (Figure 3, C ek D). I bon note ki napa okenn lekspresyon evidan NNMT dan okenn popilasyon ki eksprim PTPRC (CD45 +) (Figure 3D ek Figure S5A), ki endike ki MNA detekte dan spektak metabolit in ganny entrodwir dan bann selil T. lekspresyon aldehyde oxidase 1 (AOX1) i konverti MNA an 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) oubyen 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); Fig 3B) i osi restrikte avek popilasyon bann fibroblast ki eksprim COL1A1 (Figure S5A), ki ansanm i endike ki bann selil T napa abilite metabolism MNA konvansyonnel. Patern lekspresyon sa bann zenn ki relye avek MNA ti ganny verifye an servan en dezyenm data set selil endepandan sorti kot ascites sorti kot pasyan HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). An plis, analiz kantitatif reaksyon an lasenn polimeraz (qPCR) bann selil T donater an bonn sante ki ti ganny trete avek MNA ti montre ki konpare avek bann selil timer ovari SK-OV-3 kontrol, NNMT oubyen AOX1 ti preski pa ganny eksprimen (Figure 3E). Sa bann rezilta enprevi i endike ki MNA i kapab ganny sekrete sorti dan bann fibroblast oubyen bann timer dan bann selil T adjacent dan TME.
Malgre ki bann kandida i enkli lafanmir bann transporter katyon organik 1 a 3 (OCT1, OCT2 ek OCT3) ki ganny ankode par lafanmir porter solib 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ek SLC22A3), bann transporter potansyel MNA i ankor endefini (28) . QPCR mRNA sorti dan bann selil T donater an bonn sante ti montre bann nivo lekspresyon ba SLC22A1 me bann nivo SLC22A2 ki pa ti kapab ganny detekte, ki ti konfirm ki i ti’n ganny raporte oparavan dan literatir (Figure 3F) (29). par kont, laliny selil timer ovaryen SK-OV-3 ti eksprim bann o nivo tou le de transporter (Figure 3F).
pou teste posibilite ki bann selil T i annan abilite pou abzorb MNA etranze, bann selil T donater an bonn sante ti ganny kiltive pou 72 erdtan dan prezans diferan konsantrasyon MNA. dan labsans MNA egzozenn, konteni seliler MNA pa kapab ganny detekte (Figure 3G). Sepandan, bann selil T aktive ki ti ganny trete avek MNA egzozenn ti montre en logmantasyon depandan lo doz dan konteni MNA dan bann selil, ziska 6 mM MNA (Figure 3G). Sa rezilta i endike ki malgre sa nivo ba lekspresyon transporter e mank lanzim prensipal responsab pour metabolism MNA enterselilyer, TIL i ankor kapab pran MNA.
Spektrom bann metabolit dan bann selil T pasyan e bann eksperimantasyon abzorbsyon MNA in vitro i ogmant posibilite ki bann fibroblast asosye avek kanser (CAF) i sekrete MNA e bann selil timer i kapab regle fenotip e fonksyon TIL. pou determin lefe MNA lo bann selil T, bann selil T donater an bonn sante ti ganny aktive in vitro dan prezans ou labsans MNA, e zot proliferasyon ek prodiksyon sitokin ti ganny evalye. Apre 7 zour azout MNA a doz pli o, lakantite double popilasyon ti redwir modereman, anmenmtan ki viger ti ganny mentenir a tou doz (Figure 4A). an plis, tretman MNA egzozenn in anmenn en logmantasyon dan proporsyon bann selil CD4 + ek CD8 + T ki eksprim fakter nekroz timer-α (TNFα; Fig 4B). par kont, prodiksyon enterselilyer IFN-γ ti redwir en kantite dan bann selil CD4 + T, me pa dan bann selil CD8 + T, e ti napa okenn sanzman enportan dan interleukin 2 (IL-2; Fig 4, C ek D). Alor, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) bann sipernatan sorti dan sa bann kiltir T cell trete avek MNA ti montre en logmantasyon enportan dan TNFα, en bes dan IFN-γ, e napa sanzman dan IL-2 (Figure 4, E to G). . sa bes dan IFN-γ i endike ki MNA i kapab zwe en rol dan lenibisyon aktivite anti-tumor bann selil T. Pour kapab simul lefe MNA lo sitotoksisite medyate par selil T, bann selil resepter antizenn simerik T (FRα-CAR-T) ki target resepter folat α e CAR-T (GFP) ki ganny regle par bann selil protein fluoresan ver (GFP) -CAR-T) i ganny prodwir par bann selil mononikleer disan periferik donater an bonn sante (PBMC). bann selil CAR-T ti ganny kiltive pour 24 erdtan dan prezans MNA, e apre ko-kiltive avek bann selil timer ovaryen SK-OV-3 imen ki ti pe eksprim resepter folat α a en rapor efekter avek target 10:1. tretman MNA ti anmenn en bes enportan dan aktivite touy bann selil FRα-CAR-T, ki ti parey avek bann selil FRα-CAR-T ki ti ganny trete avek adenozin (Figure 4H).
(A) Konte total selil vyab e doubleman popilasyon (PD) direkteman sorti dan kiltir zour 7. Graf bar i reprezant mwayenn + SEM sis donater an bonn sante. reprezant lenformasyon sorti dan omwen n = 3 eksperimantasyon endepandan. (B to D) CD3/CD28 ek IL-2 ti ganny servi pou aktiviz bann selil T a zot konsantrasyon MNA respektiv pou 7 zour. avan analiz, bann selil ti ganny stimile avek PMA/ionomycin avek GolgiStop pou 4 erdtan. lekspresyon TNFα (B) dan bann selil T. legzanp zimaz (gos) ek lenformasyon tabular (drwat) lekspresyon TNFα dan bann selil vivan. lekspresyon IFN-γ (C) ek IL-2 (D) dan bann selil T. lekspresyon bann cytokine ti ganny mezire par flow cytometry. sa bar graph i reprezant mwayenn (n = 6 donater an bonn sante) + SEM. servi analiz varyans en kote e bann mezir repete (*P<0.05 e **P<0.01) pou determin valer P. reprezant lenformasyon sorti dan omwen n = 3 eksperimantasyon endepandan. (E ziska G) CD3/CD28 ek IL-2 ti ganny servi pou aktiviz bann selil T a zot konsantrasyon MNA respektiv pou 7 zour. sa medyom ti ganny kolekte avan e apre 4 erdtan stimilasyon PMA/ionomycin. bann konsantrasyon TNFα (E), IFN-γ (F) ek IL-2 (G) ti ganny mezire par ELISA. sa bar graph i reprezant mwayenn (n = 5 donater an bonn sante) + SEM. valer P determinen an servan analiz varyans en kote e bann mezir repete (*P<0.05). sa laliny pwentiye i endik limit deteksyon sa deteksyon. (H) Tes liz selil. bann selil FRα-CAR-T oubyen GFP-CAR-T ti ganny aziste avek adenozin (250μM) oubyen MNA (10 mM) pour 24 erdtan, oubyen kit san tretman (Ctrl). poursantaz lanmor bann selil SK-OV-3 ti ganny mezire. valer P determinen par tes Welch t (*P<0.5 e **P<0.01).
Pour kapab ganny en konprenezon mekanistik lo regilasyon lekspresyon TNFα ki depan lo MNA, bann sanzman dan TNFα mRNA bann selil T trete avek MNA ti ganny evalye (Figure 5A). bann selil T donater an bonn sante ki ti ganny trete avek MNA ti montre en logmantasyon de fwa dan nivo transkripsyon TNFα, ki endike ki MNA i depan lo regilasyon transkripsyon TNFα. Pour fer en lenvestigasyon lo sa mekanizm regilatwar posib, de fakter transkripsyon koni ki regle TNFα, setadir fakter nikleer selil T aktive (NFAT) e protein spesifik 1 (Sp1), ti ganny evalye an repons avek lyezon MNA avek promoter TNFα proksimal ( 30). promoter TNFα i kontenir 6 sit atasman NFAT idantifye e 2 sit atasman Sp1, ki sirkile lo en sit [-55 per baz (bp) sorti dan 5'cap] (30). Imunopresipitasyon kromatin (ChIP) ti montre ki ler ti ganny trete avek MNA, lyezon Sp1 avek promoter TNFα ti ogmante trwa fwa. lenkorporasyon NFAT in osi ogmante e apros lenportans (Figure 5B). Sa bann lenformasyon i endike ki MNA i regle lekspresyon TNFα atraver transkripsyon Sp1, e dan en pli pti degre lekspresyon NFAT.
(A) Konpare avek bann selil T kiltive san MNA, sanzman dan lekspresyon TNFα dan bann selil T ki'n ganny trete avek MNA. patern lekspresyon avek SEM i ganny montre (n = 5 donater an bonn sante). reprezant lenformasyon sorti dan omwen n = 3 eksperimantasyon endepandan. (B) Promoter TNFα bann selil T ki ti ganny trete avek ou san 8 mM MNA apre ki NFAT ek Sp1 ti ganny konbine avek (Ctrl) ek stimilasyon PMA/ionomycin pou 4 erdtan. Immunoglobulin G (IgG) ek H3 ti ganny servi koman bann kontrol negativ e pozitiv pou iminopresipitasyon, respektivman. Kantifikasyon ChIP ti montre ki lyezon Sp1 ek NFAT avek promoter TNFα dan bann selil ki ti ganny trete avek MNA ti ogmante plizyer fwa konpare avek kontrol. reprezant lenformasyon sorti dan omwen n = 3 eksperimantasyon endepandan. valer P determinen par plizyer t-test (*** P <0.01). (C) Konpare avek ascites HGSC, bann selil T (non-sitotoksik) ti montre en logmantasyon dan lekspresyon TNF dan sa timer. bann kouler i reprezant diferan pasyan. bann selil ki'n ganny demontre in ganny sample par azar a 300 e jittered pou limit overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Model propoze MNA pou kanser ovari. MNA i ganny prodwir dan bann selil timwar e fibroblast dan TME e i ganny pran par bann selil T. MNA i ogmant lyezon Sp1 avek promoter TNFα, ki anmenn ver en logmantasyon dan transkripsyon TNFα e prodiksyon sitokin TNFα. MNA i osi koz en bes dan IFN-γ. lenibisyon fonksyon T cell i anmenn en rediksyon dan abilite touye e krwasans timer akselere.
dapre bann rapor, TNFα i annan bann lefe anti-tumer ek anti-tumor ki depan lo devan e deryer, me i annan en rol byen koni dan promosyon krwasans ek metastaz kanser ovari (31-33). dapre bann rapor, konsantrasyon TNFα dan bann tisi ascites ek timer dan bann pasyan avek kanser ovari i pli o ki sa dan bann tisi benign (34-36). an term mekanizm, TNFα i kapab regle aktivasyon, fonksyon e proliferasyon bann selil blan, e sanz fenotip bann selil kanser (37, 38). Konsistan avek sa bann konsta, analiz lekspresyon zenn diferansyel ti montre ki TNF ti ganny regle dan bann selil T dan bann tisi timer konpare avek ascites (Figure 5C). logmantasyon dan lekspresyon TNF ti selman evidan dan bann popilasyon selil T avek en fenotip non-sitotoksik (Figure S5A). an bref, sa bann lenformasyon i siport pwennvi ki MNA i annan doub lefe imunosupresiv e promosyon timer dan HGSC.
Labeling fluoresan baze lo flow cytometry in vin metod prensipal pou etidye metabolism TIL. Sa bann letid in montre ki konpare avek bann lenfosit disan periferik oubyen bann selil T sorti dan bann lorgann lenfoid segonder, TIL murine ek imen i annan en tandans pli o pou absorp glikoz (4, 39) e pert gradyel fonksyon mitokondriyal (19, 40). Malgre ki nou'n obzerv bann rezilta parey dan sa letid, devlopman kle se pou konpar metabolism bann selil timer ek TIL sorti dan menm tisi timer ki'n ganny retire. Konsistan avek serten sa bann rapor presedan, bann selil timer (CD45-EpCAM +) sorti dan ascites ek timer i annan en pli o absorpsyon glikoz ki bann selil CD8 + ek CD4 + T, ki siport ki absorpsyon glikoz o dan bann selil timer i kapab ganny konpare avek bann selil T. konsep konpetisyon selil T. TME. Sepandan, aktivite mitokondriyal bann selil timer i pli o ki pour bann selil CD8 + T, me aktivite mitokondriyal i parey pour bann selil CD4 + T. Sa bann rezilta i ranforsi sa tenm ki pe emerze ki metabolism oksidativ i enportan pou bann selil timer (41, 42). zot osi sizere ki bann selil CD8 + T i kapab pli sansib a disfonksyonnman oksidatif ki bann selil CD4 + T, oubyen ki bann selil CD4 + T i kapab servi bann sours karbonn apard ki glikoz pou mentenir aktivite mitokondriyal (43, 44). i devret ganny note ki nou pa'n obzerv okenn diferans dan absorpsyon glikoz ou aktivite mitokondriyal ant bann efekter CD4 + T, memwar efekter T e bann selil memwar santral T dan ascites. Pareyman, leta diferansyasyon bann selil CD8 + T dan bann timer napa nanryen pou fer avek bann sanzman dan absorpsyon glikoz, ki fer resorti diferans enportan ant bann selil T kiltive in vitro ek TIL imen in vivo (22). Sa bann lobzervasyon ti osi ganny konfirmen par litilizasyon alokasyon popilasyon selil otomatik san prezidis, ki ti osi revele ki bann selil CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + avek en pli o absorpsyon glikoz e aktivite mitokondriyal ki bann selil timer i prevalan me i annan popilasyon selil aktiv metabolik. Sa popilasyon i kapab reprezant sa sou popilasyon potatif bann selil sipreser myeloid oubyen bann selil dendritik plasmasitoid idantifye dan analiz scRNA-seq. Malgre ki tou le de in ganny raporte dan bann timer ovari imen [45], zot ankor bezwen travay pli profon se pou dekrir sa sou-popilasyon myeloid.
Malgre ki bann metod baze lo flow cytometry i kapab klarifye bann diferans zeneral dan glikoz ek metabolism oksidatif ant bann kalite selil, bann metabolit presi prodwir par glikoz ou lezot sours karbonn pou metabolism mitokondriyal dan TME pa ankor ganny determinen. donn prezans ou labsans bann metabolit avek en sou-group TIL i demann pirifikasyon popilasyon selil dan tisi ki'n ganny koupe. Alor, nou metod lanrisisman selil konbine avek spektrometri mas i kapab donn bann apersi lo bann metabolit ki ganny anrisir dan bann selil T ek popilasyon selil timer dan bann lesantiyon pasyan ki koresponn. Menm si sa metod i annan lavantaz lo triyaz selil aktive par fluoresans, serten bibliotek metabolit i kapab ganny afekte akoz stabilite eneren e/oubyen to turnover rapid (22). kantmenm sa, nou metod ti kapab idantifye de metabolit imunosupresiv rekonnet, adenozin ek kynurenine, akoz zot varye bokou ant bann kalite lesantiyon.
nou analiz metabolomik bann timer ek bann sou-tip TIL i donn plis apersi lo rol bann metabolit dan TME ovari. Premyerman, an servan flow cytometry, nou ti determinen ki ti napa okenn diferans dan aktivite mitokondriyal ant bann timer ek bann selil CD4 + T. Sepandan, analiz LC-MS/MS in revel bann sanzman enportan dan labondans bann metabolit parmi sa bann popilasyon, ki endike ki bann konklizyon lo metabolism TIL e son aktivite metabolik an zeneral i demann en enterpretasyon pridan. dezyenmman, MNA i sa metabolit avek pli gran diferans ant bann selil CD45 ek bann selil T dan ascites, pa bann timer. Alor, konpartimantalizasyon ek lokasyon timer i kapab annan diferan lefe lo metabolism TIL, ki fer resorti eterozenite posib dan en mikrolanvironnman donnen. Trwazyenmman, lekspresyon lanzim ki prodwi MNA NNMT i prensipalman limite avek CAF, ki bann selil timer dan en pli pti degre, me bann nivo MNA detektab i ganny obzerve dan bann selil T ki sorti dan timer. overekspresyon NNMT dan CAF ovari i annan en lefe promosyon kanser koni, an parti akoz promosyon metabolism CAF, lenvazyon timer e metastaz (27). Menm si nivo zeneral TIL i modere, lekspresyon NNMT dan CAF i pros avek sou-tip mezensim Cancer Genome Atlas (TCGA), ki asosye avek move pronostik (27, 46, 47). Finalman, lekspresyon lanzim AOX1 responsab pour degradasyon MNA i osi limite avek popilasyon CAF, ki endike ki bann selil T napa abilite pour metaboliz MNA. Sa bann rezilta i siport lide ki malgre ki plis travay i neseser pou verifye sa konsta, bann o nivo MNA dan bann selil T i kapab endik prezans en mikrolanvironnman CAF imunosupresiv.
an vi nivo lekspresyon ba bann transporter MNA e nivo endetektab bann protein kle ki enplike dan metabolism MNA, prezans MNA dan bann selil T i enprevi. ni NNMT ni AOX1 pa ti kapab ganny detekte par analiz scRNA-seq e qPCR targete de cohort endepandan. Sa bann rezilta i endike ki MNA pa ganny sentetize par bann selil T, me i ganny abzorbe avek TME otour. bann eksperimantasyon in vitro i montre ki bann selil T i annan tandans pou akimil MNA egzozenn.
nou bann letid in vitro in montre ki MNA egzozenn i ensit lekspresyon TNFα dan bann selil T e i amelyor lyezon Sp1 avek promoter TNFα. Malgre ki TNFα i annan tou le de fonksyon anti-timer e anti-timer, dan kanser ovari, TNFα i kapab promot krwasans kanser ovari (31-33). Netralizasyon TNFα dan kiltir selil timer ovari oubyen eliminasyon sinyal TNFα dan bann model sourit i kapab amelyor prodiksyon sitokin enflamatwar medyate par TNFα e anpes krwasans timer (32, 35). Alor, dan sa ka, MNA ki sorti dan TME i kapab azir koman en metabolit pro-enflamatwar atraver en mekanizm ki depan lo TNFα atraver sa boukl otokrin, e par sa promot larive e propagasyon kanser ovari (31). Baze lo sa posibilite, blokaz TNFα pe ganny etidye koman en azan terapeutik potansyel pou kanser ovari (37, 48, 49). an plis, MNA i afekte sitotoksisite bann selil CAR-T pour bann selil timer ovari, ki donn plis levidans pour sipresyon iminiter medyate par MNA. kolektivman, sa bann rezilta i sizer en model dan lekel bann timer ek bann selil CAF i sekrete MNA dan TME ekstraselilyer. atraver (i) stimilasyon krwasans kanser ovari koze par TNF e (ii) lenibisyon aktivite sitotoksik selil T koze par MNA, sa i kapab annan en lefe doub timer (Figure 5D).
An konklizyon, par aplik en konbinezon lanrisisman selil rapid, sekansman selil tousel e profilaz metabolik, sa letid in revel bann gran diferans iminometabolomik ant bann timer ek bann selil ascites dan bann pasyan HGSC. Sa analiz konpreansiv in montre ki i annan diferans dan absorpsyon glikoz e aktivite mitokondriyal ant bann selil T, e in idantifye MNA koman en metabolit regilatwar iminiter non-selil otononm. sa bann lenformasyon i annan en lenpak lo ki mannyer TME i afekte metabolism T cell dan bann kanser imen. Malgre ki konpetisyon direk pou bann nitriman ant bann selil T ek bann selil kanser in ganny raporte, bann metabolit i osi kapab azir koman bann regilater endirek pou promot progresyon timer e posibleman siprime bann larepons iminiter endozenn. Deskripsyon pli profon lo rol fonksyonnel sa bann metabolit regilatwar i kapab ouver bann stratezi alternativ pou amelyor larepons iminiter anti-tumer.
bann spesimenn pasyan ek lenformasyon klinik ti ganny obtenir atraver repozitwar tisi timer kanser BC sertifye par Canadian Tissue Repository Network. Dapre protokol aprouve par Komite Etik Resers Kanser BC e Liniversite British Columbia (H07-00463), tou bann spesimenn pasyan ek lenformasyon klinik ti ganny konsantman enformen an ekri oubyen formelman renons zot konsantman. bann lesantiyon i ganny stoke dan BioBank sertifye (BRC-00290). bann karakteristik pasyan detaye i ganny montre dan latab S1 ek S5. Pour kriyoprezervasyon, en bistouri i ganny servi pour dekonpoz mekanikman lesantiyon timer pasyan e apre pous li atraver en filter 100-mikron pour ganny en sispansyon selil tousel. ascites pasyan ti ganny santrifize a 1500 rpm pou 10 minit a 4°C pou pelet bann selil e retir sa sipernatan. bann selil ki ti ganny obtenir avek timer ek asit ti ganny krioprezerve dan 50% serom AB imen ki ti ganny inaktive par lasaler (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) e 10% dimethyl sulfoxide. sa bann sispansyon selil tousel prezerve ti ganny dekonpoze e servi pou metabolomik ek determinasyon metabolit ki ganny dekrir anba.
sa medyom konplet i konpoze avek 0.22 μm filtre 50:50 konplemante RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) konplemante avek 10% serom AB imen inaktiv par lasaler (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 solisyon Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ek 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) i ganny konplemante avek 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). tampon kolorasyon flow cytometer ti konpoze avek 0.22μm saline tampon fosfat filtre (PBS; Invitrogen) konplemante avek 3% serom imen AB inaktiv par lasaler (Sigma). tampon lanrisisman selil i konpoze avek 0.22μm PBS filtre e konplemante avek 0.5% serom AB imen inaktiv par lasaler (Sigma-Aldrich).
dan en medyom konplet 37°C, bann selil ti ganny kolore avek 10 nM MT DR e 100 μM 2-NBDG pou 30 minit. apre, bann selil ti ganny kolore avek tenn viabilite eF506 a 4°C pou 15 minit. Resuspend bann selil dan FC Block (eBioscience) ek Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), dilye dan flow cytometer staining buffer (dapre lenstriksyon fabrikan), e enkile pour 10 minit a tanperatir lasanm. kolorye bann selil avek en set antikor (latab S2) dan en tampon kolorasyon flow cytometry a 4°C pou 20 minit. resuspend bann selil dan flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) avan analiz. servi SpectroFlo ek FlowJo V10 pou analiz lenformasyon lo lakantite selil, e servi GraphPad Prism 8 pou kree lenformasyon. lentansite fluoresans medyan (MFI) 2-NBDG ek MT DR ti ganny log-normalize, e apre en tes t per ti ganny servi pou analiz statistik pou pran kont bann pasyan ki ti ganny matche. retir tou popilasyon avek mwens ki 40 levennman dan analiz; antre en valer MFI 1 pou nenport valer negativ avan fer analiz statistik ek vizyalisasyon lenformasyon.
Pour kapab konplemant stratezi gating mannyel sa pano prosesis anler, nou ti servi lanotasyon konplet par pye restriksyon laform (FAUST) (21) pour otomatikman donn bann selil avek popilasyon apre ki nou'n elimin bann selil mor dan FlowJo. nou zer rezilta mannyelman pou zwenn bann popilasyon ki paret mal aloke (konbin PD1+ avek bann selil timer PD1) e bann popilasyon ki'n ganny retenir. sak lesantiyon i kontenir en mwayenn plis ki 2% selil, pou en total 11 popilasyon.
santrifigasyon dansite gradient Ficoll ti ganny servi pou separ PBMC avek bann prodwi separasyon lekosit (STEMCELL Technologies). bann selil CD8 + T ti ganny izole avek PBMC an servan CD8 MicroBeads (Miltenyi) e agrandi dan en medyom konplet an servan TransAct (Miltenyi) pour 2 semenn dapre lenstriksyon fabrikan. bann selil ti ganny les debout pour 5 zour dan en medyom konplet ki ti annan IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), e apre re-stimile avek TransAct. zour 7, dapre lenstriksyon fabrikan, CD45 MicroBeads imen (Miltenyi) ti ganny servi pou anrisir bann selil dan trwa tour konsekitiv. bann selil ti ganny aliquote pou analiz flow cytometry (parey in ganny dekrir pli o), e en milyon selil ti ganny aliquote trwa fwa pou analiz LC-MS/MS. bann lesantiyon ti ganny prosese par LC-MS/MS parey in ganny dekrir anba. nou ti estimen valer metabolit ki manke avek en nonm ion 1,000. sak lesantiyon i ganny normalize par nimero ion total (TIC), konverti logaritmikman e otomatikman normalize dan MetaboAnalystR avan analiz.
sispansyon selil tousel sak pasyan ti ganny dekonpoze e filtre atraver en filter 40 μm dan en medyom konplet (parey in ganny dekrir pli o). dapre protokol fabrikan, trwa tour konsekitiv seleksyon pozitiv par separasyon perl magnetik an servan MicroBeads (Miltenyi) ti ganny servi pou anrisir bann lesantiyon pour CD8+, CD4+ e CD45- selil (lo ice). an bref, bann selil i ganny resuspend dan en tampon lanrisisman selil (parey in ganny dekrir pli o) e konte. bann selil ti ganny enkile avek bann perl CD8 imen, bann perl CD4 imen oubyen bann perl CD45 imen (Miltenyi) a 4°C pour 15 minit, e apre lave avek en tampon lanrisisman selil. sa lesantiyon i ganny pase atraver kolonn LS (Miltenyi), e bann fraksyon pozitiv ek negativ i ganny kolekte. Pour redwir dirasyon e maksimiz letap rekiperasyon selil, fraksyon CD8 i apre ganny servi pour dezyenm tour lanrisisman CD4+, e fraksyon CD4 i ganny servi pour lanrisisman CD45 ki swiv. gard solisyon lo ice pandan prosesis separasyon.
pou prepar bann lesantiyon pou analiz metabolit, bann selil ti ganny lave en fwa avek solisyon disel fre, e 1 ml 80% metanol ti ganny azoute avek sak lesantiyon, apre vortex e konzele dan azot likid. bann lesantiyon ti ganny soumet avek trwa sikl freeze-thaw e santrifize a 14,000 rpm pou 15 minit a 4°C. sa sipernatan ki annan bann metabolit i ganny evapore ziska i sek. bann metabolit ti ganny re-fonn dan 50 μl 0.03% lasid formik, vortexed pou melanze, e apre santrifize pou retir debri.
tir bann metabolit parey in ganny dekrir pli o. transfer sa sipernatan dan en boutey kromatografi likid o performans pou resers metabolomik. servi en protokol tretman o aza pou tret sak lesantiyon avek en kantite selil parey pou anpes bann lefe lo. nou ti fer en evalyasyon kalitatif bann metabolit global ki ti'n ganny pibliye oparavan lo AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). analiz kromatografik ek lentegrasyon rezyon pik ti ganny fer an servan lozisyel MultiQuant versyon 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
En kont ion 1000 ti ganny servi pou estimen valer metabolit ki ti manke, e TIC sak lesantiyon ti ganny servi pou kalkil rezyon pik normalize sak metabolit detekte pou koriz bann sanzman entrodwir par analiz enstrimantal sorti dan prosesis lesantiyon. Apre ki TIC in ganny normalize, MetaboAnalystR(51) (paramet par defo) i ganny servi pou konversyon logaritmik e laliny norm otomatik. nou ti servi PCA avek vegan R package pou fer analiz eksploratwar lo diferans metabolom ant bann kalite lesantiyon, e servi analiz redondans parsyel pou analiz pasyan. servi metod Ward pou konstrir en dendrogram map lasaler pou group zistans Euclidean ant bann lesantiyon. nou ti servi limma (52) lo labondans metabolit standarize pou idantifye bann metabolit diferansyelman abondan atraver kalite selil antye e mikrolanvironnman. pou senplifye leksplikasyon, nou servi paramet mwayenn group pou spesifye model, e konsider bann kalite selil dan mikrolanvironnman koman sak group (n = 6 group); pou tes sinifikasyon, nou ti fer trwa mezir repete pou sak metabolit Pour evit fo replikasyon, pasyan ti ganny enkli koman en lobstak dan konsepsyon limma. pou kapab tyek bann diferans dan bann metabolit ant bann diferan pasyan, nou'n aziste model limma enkli bann pasyan dan en fason fiks. nou raport lenportans kontras pre-spesifye ant kalite selil ek mikrolanvironnman Padj <0.05 (koreksyon Benjamini-Hochberg).
Apre lanrisisman viger an servan Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilite), sekansman transkriptom selil tousel ti ganny fer lo bann lesantiyon ascites vivan konzele ek timer an servan en protokol lekspresyon 10x 5′zenn. senk ka avek bann timer ek ascites ki ti parey ti ganny analize, menm si viabilite ba sorti dan en lesantiyon timer ti anpes son lenklizyon. pou kapab ganny plizyer seleksyon pasyan, nou ti konbin bann lesantiyon sak pasyan dan bann lane kontroler 10x chromium, e analiz bann sit ascites ek timer separeman. Apre sekansman [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; en mwayenn 73,488 e 41,378 lektir par selil pour timer ek ascites respektivman]], nou ti servi CellSNP ek Vireo (53) (baze lo CellSNP koman The common human SNP (VCF) provided by GRCh38 is assigned a donor identity. Nou servi SNPRelate pour enfer sa pli pros idantite (IBS) stati zenotip pasyan (IBS) eksklir bann selil ki pa'n ganny plase e bann selil ki'n ganny idantifye koman bann duplex e bann donater ki koresponn ant bann lesantiyon ascites ek timer (54). (2792 ek 4183 selil sorti dan timer ek asit, respektivman) pou analiz Nou servi groupman igraph (57) Louvain of shared nearest neighbor network (SNN) baze lo zistans Jaccard avek bann selil groupman par lekspresyon. bann selil i ganny definir par lekspresyon CD8A ek GZMA, eksklir bann sou-grup avek lekspresyon protein ribozomal ba. Nou'n ganny akse avek lenformasyon pibliye par Izar et al (16), enkli zot t-SNE embedding, i kapab kontrol sirplis lekspresyon ant bann marker selil iminiter ek lekspresyon NNMT.
PBMC ti ganny separe avek bann prodwi separasyon lekosit (STEMCELL Technologies) par santrifigasyon dansite gradient Ficoll. bann selil CD3 + ti ganny izole avek PBMC an servan bann perl CD3 (Miltenyi). dan prezans ou labsans MNA, bann selil CD3+ ti ganny aktive avek CD3 (5μg/ml), CD28 solib (3μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Dernyen zour lagrandisman, viabilite (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ek proliferasyon (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ti ganny evalye par flow cytometry. evalye fonksyon efekter par stimil bann selil avek PMA (20 ng/ml) e ionomycin (1μg/ml) avek GolgiStop pou 4 erdtan, e sirvey CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) e TNFα-fluoresceinsothianate (TCMA-T4), MA BD). stimil bann selil qPCR ek ChIP avek PMA (20 ng/ml) ek ionomycin (1μg/ml) pou 4 erdtan. Sipernatan ELISA ti ganny kolekte avan e apre stimilasyon avek PMA (20 ng/ml) ek ionomycin (1 μg/ml) pou 4 erdtan.
swiv protokol fabrikan pou izol RNA an servan RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). servi QIAshredder (QIAGEN) pou omozeniz sa lesantiyon. servi en kit RNA avek cDNA o kapasite (Thermo Fisher Scientific) pou sentez DNA konplemanter (cDNA). servi TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pou kantifye lekspresyon zenetik (dapre protokol fabrikan) avek sa bann sond swivan: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427555m151,1212 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ek Hs01010726_m1 (SLC22A2). bann lesantiyon ti ganny fer marse lo sistenm PCR an tan reel StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) dan plak reaksyon 96-well optik vit MicroAmp (Applied Biosystems) avek film optik MicroAmp. nenport valer Ct ki depas 35 i ganny konsidere koman par lao threshold deteksyon e i ganny marke koman pa detektab.
fer ChIP parey in ganny dekrir oparavan (58). an bref, bann selil ti ganny trete avek formaldehyde (konsantrasyon final 1.42%) e enkile a tanperatir lasanm pou 10 minit. servi en tampon anfleman siplemanter (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0.1% NP-40) lo ice pou 10 minit, apre resuspend dan en tampon iminopresipitasyon parey in ganny dekrir (58 ). sa lesantiyon ti apre ganny sonik avek sa bann sikl swivan: 10 sikl (20 batman leker 1 segonn) e en letan statik 40 segonn. Enkuba bann antikor ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) e SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) avek lesantiyon a 4°CC tranble pandan lannwit. Enkuba bann perl protein A (Thermo Fisher Scientific) avek lesantiyon a 4°C avek dousman sekwe pour 1 erdtan, apre servi bann perl chelex (Bio-Rad) pour anrisir DNA, e servi proteinase K (Thermo Fisher) pour dizesyon protein. promoter TNFα ti ganny detekte par PCR: devan, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; o kontrer, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp prodwi). bann zimaz ti ganny prodwir par Image Lab (Bio-Rad) e kantifye an servan lozisyel ImageJ.
sa sipernatan kiltir selil ti ganny kolekte parey in ganny dekrir pli o. determinasyon ti ganny fer dapre bann prosedir fabrikan pour kit ELISA TNFα imen (Invitrogen), kit ELISA IL-2 imen (Invitrogen) e kit ELISA IFN-γ imen (Abcam). dapre protokol fabrikan, sa sipernatan ti ganny dilye 1:100 pou detekte TNFα ek IL-2, e 1:3 pou detekte IFN-γ. servi EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) pou mezir absorbans a 450 nm.
PBMC ti ganny separe avek bann prodwi separasyon lekosit (STEMCELL Technologies) par santrifigasyon dansite gradient Ficoll. bann selil CD3 + ti ganny izole avek PBMC an servan bann perl CD3 (Miltenyi). dan prezans ou labsans MNA, bann selil CD3+ ti ganny aktive avek CD3 (5μg/ml), CD28 solib (3μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) pou 3 zour. apre 3 zour, bann selil ti ganny kolekte e lave avek 0.9% saline, e sa pelet ti ganny konzele. konte selil ti ganny fer par flow cytometry (Cytek Aurora; konfigirasyon 3L-16V-14B-8R) an servan 123count eBeads.
tir bann metabolit parey in ganny dekrir pli o. sa ekstrak sek ti ganny rekonstitye a en konsantrasyon 4000 ekivalan selil/μl. analiz sa lesantiyon par kromatografi faz ranverse (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e kolonn CORTECS T3 (2.1×150 mm, groser partikil 1.6-μm, groser por 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometr mas poler (6470, Agilent), dan ki ionizasyon electrospray i fonksyonn dan en mod pozitiv. faz mobil A i 0.1% lasid formik (dan H2O), faz mobil B i 90% asetonitril, 0.1% lasid formik. Gradient LC i 0 a 2 minit pour 100% A, 2 a 7.1 minit pour 99% B, e 7.1 a 8 minit pour 99% B. Apre re-ekilibre sa kolonn avek faz mobil A a en debi 0.6 ml/min pour 3 minit. . debi i 0.4ml/min, e lasanm kolonn i ganny sofe a 50°C. servi standar simik pir MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) pou etablir letan retansyon (RT) ek transformasyon (RT = 0.882 minit, transformasyon 1 = 137→94.1, transformasyon 2 = 137→92 , Konversyon = 3→ 37→78). ler tou le trwa tranzisyon i arive a sa moman retansyon korek, tranzisyon 1 i ganny servi pou kantite pou asir spesifisite. kourb standar MNA (Toronto Research Chemical Company) ti ganny prodwir par sis dilye serial solisyon stok (1 mg/ml) pou obtenir standar 0.1, 1.0, 10 e 100 ng/ml e 1.0 e 10μg/ml respektivman likid. limit deteksyon i 1 ng/ml, e larepons lineer i ant 10 ng/ml ek 10μg/ml. sak linjeksyon de mikrolit lesantiyon ek standar i ganny servi pou analiz LC/MS, e en lesantiyon kontrol kalite melanze i ganny fer tou le wit linjeksyon pou asir stabilite platform analiz. bann larepons MNA tou bann lesantiyon selil trete avek MNA ti dan ran lineer sa tes. analiz lenformasyon ti ganny fer an servan lozisyel analiz kantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
dezyenm zenerasyon konstriksyon αFR-CAR ti ganny tire avek Song et al. (59). an bref, sa konstriksyon i konteni sa bann konteni swivan: sekans leader CD8a, fragman varyab lasenn en sel spesifik αFR imen, charnier CD8a ek rezyon transmembrane, domenn entraselilyer CD27 e domenn entraselilyer CD3z. Sekans CAR konplet ti ganny sentetize par GenScript, e apre klone dan dezyenm zenerasyon vekter lekspresyon lentiviral anler avek kaset lekspresyon GFP ki ti ganny servi pou evalye lefikasite transdiksyon.
Lentivirus i ganny prodwir par transfeksyon bann selil HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); kiltive dan Dulbecco's modifye Eagle medium ki kontenir 10% fetal bovine serom (FBS) ek 1% PenStrep, e servi CAR-GFP vector e bann plasmid lanbalaz (psPAX2 ek pMD2.G, Addgene) i servi lipofection amine (Sigma-Aldrich). sa sipernatan ki ti annan viris ti ganny kolekte 48 e 72 erdtan apre transfeksyon, filtre, e konsantre par ultrasantrifigasyon. stor sa sipernatan viral konsantre a -80°C ziska transdiksyon.
PBMC i ganny separe avek bann prodwi separasyon lekosit donater an bonn sante (STEMCELL Technologies) par santrifigasyon dansite gradient Ficoll. servi bann mikroperl CD8 seleksyon pozitiv (Miltenyi) pou izol bann selil CD8+ avek PBMC. stimil bann selil T avek TransAct (Miltenyi) e dan medyom TexMACS [Miltenyi; konplemante avek 3% serom imen inaktiv par lasaler, 1% PenStrep ek IL-2 (300 U/ml)]. vennkat erdtan apre stimilasyon, bann selil T ti ganny transdwir avek lentivirus (10 μl sipernatan viris konsantre par 106 selil). 1 a 3 zour apre transdiksyon lo Cytek Aurora (lo FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evalye lekspresyon GFP bann selil pou demontre en lefikasite transdiksyon omwen 30% .
bann selil CAR-T ti ganny kiltive pour 24 erdtan dan Immunocult (STEMCELL Technologies; konplemante avek 1% PenStrep) anba sa bann kondisyon swivan: pa'n ganny trete, trete avek 250 μM adenosine oubyen 10 mM MNA. Apre pretretman, bann selil CAR-T ti ganny lave avek PBS e konbine avek 20,000 selil SK-OV-3 [ATCC; dan medyom McCoy 5A (Sigma-Aldrich) konplemante avek 10% FBS e 1% PenStrep a 10: Rapor efekter avek target 1 ti ganny anplifye an triplik dan medyom Immunocult konplemante. bann selil SK-OV-3 ek bann selil SK-OV-3 ki ti ganny lyse avek digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ti ganny servi koman bann kontrol negativ e pozitiv, respektivman. Apre 24 erdtan ko-kiltivasyon, sa sipernatan ti ganny kolekte e lactate dehydrogenase (LDH) ti ganny mezire dapre lenstriksyon fabrikan (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). sipernatan LDH ti ganny dilye 1:50 dan tampon LDH. poursantaz lanmor ti ganny mezire an servan sa formil swivan: poursantaz lanmor = poursantaz koreksyon / to lanmor maksimonm x 100%, kot poursantaz koreksyon = ko-kiltir-selil T selman, e to lanmor maksimonm = kontrol pozitiv-kontrol negativ.
parey in ganny dekrir dan teks oubyen materyo ek metod, servi GraphPad Prism 8, Microsoft Excel oubyen R v3.6.0 pou analiz statistik. si plizyer lesantiyon i ganny kolekte avek menm pasyan (tel ki asit ek timer), nou servi en tes t per oubyen enkli pasyan koman en lefe o aza dan en model lineer oubyen zeneralize parey i apropriye. pou analiz metabolomik, tes lenportans i ganny fer an trwa kopi.
Pour bann materyo siplemanter pour sa lartik, silvouple vwar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Sa i en lartik akse ouver ki ganny distribye anba bann term Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ki permet litilizasyon, distribisyon e reprodiksyon dan nenport ki medyom, tan ki litilizasyon final pa pour benefis komersyal e premis se ki travay orizinal i korek. Referans.
Not: Nou zis demann ou pou donn ou ladres imel pou ki sa dimoun ki ou rekomande lo sa paz i konnen ki ou anvi zot vwar sa imel e ki i pa spam. nou pa pou kaptir okenn ladres imel.
sa kestyon i ganny servi pou teste si ou en viziter e anpes soumisyon spam otomatik.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R.R.R.R.R.R.Bellson). Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA i kontribye dan sipresyon iminiter bann selil T e i reprezant en target iminoterapi potansyel pou tretman kanser imen.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R.R.R.R.R.R.Bellson). Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA i kontribye dan sipresyon iminiter bann selil T e i reprezant en target iminoterapi potansyel pou tretman kanser imen.
©2021 Lasosyasyon Ameriken pou Lavansman Lasyans. tou drwa rezerve. AAAS i en partener HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ek COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.