triyaz protein dan semen sekreter i esansyel pou mentenir konpartimantalizasyon selil e omeostaz. an plis ki triyaz medyate par kokiy, rol bann lipid dan triyaz kinesin dan prosesis transpor sekreter i en kestyon debaz ki pa ankor ganny reponn. La, nou fer zimaz 3D anmenmtan miltikolor o rezolisyon an tan reel pou prouve in vivo ki bann nouvo protein glikozilfosfatidilinositol-imobilize avek bann morso lipid seramid tre long i ganny groupe e klasifye dan endoplasm spesyalize Net exit site, ki diferan avek sa ki ganny servi par bann protein transmembrane. an plis, nou montre ki longer lasenn seramid dan manbràn retikil endoplasmik i kritik pou sa selektivite triyaz. nou letid i fourni premye levidans direk in vivo pou klasifye bann kargezon protein baze lo longer lasenn lipid dan bann sit eksportasyon selektif dan semen sekreter.
dan bann selil ekaryotik, bann protein ki ganny sentetik dan retikil endoplasmik (ER) i apre ganny triye pandan transpor atraver semen sekreter pou livrezon kot zot destinasyon seliler apropriye (1). An plis ki triyaz medyate par kouvertir, i ti ganny spekile depi lontan ki serten lipid i osi kapab servi koman bann pwen sorti selektif par group zot dan bann domenn manbràn spesifik ki bann protein spesifik (2-5). Sepandan, i ankor annan en mankman levidans direk in vivo pou prouv sa mekanizm posib baze lo lipid. pou rezourd sa problenm debaz, nou'n etidye dan lelven ki mannyer bann protein ankre glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) i ganny eksporte dan en fason diferan sorti dan ER. GPI-APs i en varyete protein sirfas selil ki konekte avek lipid ( 6, 7). GPI-AP i en protein sekrete ki atase avek bann feyaz eksteryer manbràn plasma atraver parti glikolipid (lank GPI). zot aksepte bann lank GPI koman bann modifikasyon post-translasyonnel konservativ dan lim ER (8). apre latasman, GPI-AP i pas atraver laparey Golgi (5, 9) sorti kot ER ziska manbràn plasma. prezans bann lank GPI i fer ki GPI-AP i ganny transporte separeman avek bann protein sekrete transmembrane (enkli lezot protein manbràn plasma) lo semen sekreter (5, 9, 10). dan bann selil lelven, GPI-APs i ganny separe avek lezot protein sekrete dan retikil endoplasmik, e apre i ganny anpakte dan bann vezikil inik anvlope par konpleks protein kouvertir II (COPII) (6, 7). bann determinan sa prosesis klasifikasyon dan prosesis eksportasyon ER i pa kler, me i ganny spekile ki sa mekanizm i kapab demann lipid, sirtou remodelasyon striktirel porsyon lipid lank GPI (5, 8). dan lelven, remodelasyon lipid GPI i komanse imedyatman apre ki GPI i atase, e dan bokou ka, i fer seramid atase avek 26-karbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). C26 ceramide i ceramide prensipal prodwir par bann selil lelven ziska prezan. i ganny sentetik dan ER e laplipar i ganny eksporte dan laparey Golgi atraver bann vezikil COPII (13). leksportasyon ER GPI-AP i spesifikman demann en sentes ceramide kontinyel (14, 15), e an retour, konversyon ceramide an inositol phosphate ceramide (IPC) dan laparey Golgi i depan lo sentes lank GPI (16). bann letid biofizik avek bann manbràn artifisyel in montre ki bann seramid lasenn asil tre long i kapab zwenn ansanm pou form bann domenn annord avek bann propriyete fizik inik (17, 18). Sa bann lenformasyon i anmenn ver sa ipotez ki C26 ceramide ek GPI-AP avek C26 ceramide i servi zot bann propriyete fizik pou zwenn dan bann rezyon annord oubyen bann rezyon dan lanvironnman lipid manbràn ER ki relativman dezordonnen. i prensipalman konpoze avek bann gliserolipid kourt e ensatire (C16:1 ek C18:1) (19, 20). Sa bann rezyon pou ganny konsantre selektivman lo bann sit sorti ER spesifik (ERES), kot GPI-AP baze lo seramid ek seramid i kapab ganny ko-transporte dan Golgi dan menm vezikil COPII dedye (5).
dan sa letid, nou'n teste direkteman sa mekanizm baze lo lipid an servan mikroskopi zimazri konfokal an tan-reel siper-rezolisyon (SCLIM), ki en teknik mikroskopi avangard ki kapab anmenmtan obzerv bann protein ki'n ganny marke avek fluoresans.
Nou ti premyerman aplik teknolozi SCLIM pou definir plis ki mannyer GPI-AP normal avek group C26 ceramide ti ganny selekte sorti dan bann protein sekrete transmembrane apre kit ER dan S. cerevisiae. Pou kapab tyek klasifikasyon ER, nou ti servi en sistenm zenetik ki kapab vizyalize direkteman bann nouvo kargezon sentetik ki antre dan ERES in vivo (7, 23). koman kargezon, nou ti swazir C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 marke avek protein fluoresan ver (GFP) e protein sekrete transmembrane Mid2 marke avek protein fluoresan pre-enfrarouz (iRFP), tou le de ki target manbràn plasma (24-26). dan sa mitan sansib a tanperatir sec31-1, sa de kargezon i ganny eksprimen anba en promoter ki kapab ganny endwir par galaktoz e en marker ERES konstititiv. a en tanperatir ekstrenm (37°C), akoz mitasyon sec31-1 i afekte fonksyon konponan kouvertir COPII Sec31 pou anpes zerminasyon COPII e leksportasyon ER, nouvo kargezon sentetik i akimile kot ER (23). Apre ki in refwadi a en tanperatir ba (24°C), bann selil mitan sec31-1 in rekipere dan landrwa sekreter, e nouvo kargezon sentetik ki'n akimile in konmans ganny eksporte sorti dan ER. vizyalisasyon CLIM ti montre ki laplipar bann nouvo Gas1-GFP ek Mid2-iRFP ti ankor akimile dan ER bann selil mitan sec31-1 apre enkubasyon a 37°C e apre ganny large a 24°C pou 5 minit (Figure 1). Vi ki Mid2-iRFP i ganny distribye lo manbràn ER antye, e Gas1-GFP i ganny konsantre e anmase dan rezyon manbràn ER diskontinyel, zot distribisyon i konpletman diferan (Figure 1, A ziska C e Film S1). an plis, parey i ganny montre dan figir 1D, sa group Gas1-GFP napa Mid2-iRFP. Sa bann rezilta i endike ki GPI-AP ek bann protein transmembrane ti ganny separe dan diferan rezyon manbràn ER boner. sa group Gas1-GFP i adjacent avek en ERES spesifik ki'n ganny marke avek mCherry's COPII coat protein Sec13 (Figure 1, E ek F, ek film S1) (23).
bann selil sec31-1 i eksprim bann sekresyon endwir par galaktoz, en long lasenn asil (C26) seramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ver) e protein transmembrane Mid2-iRFP (TMP, ble) e sa ERES konstriktiv ki marke Sec13-mCherry (E) ti ganny enkile pour 30°C minit, bouze a 24°C, e zimaz par SCLIM 5 minit pli tar. (A ziska C) i montre en reprezantatif zimaz 2D zwenn oubyen tousel en avyon (A), en zimaz prozeksyon 2D 10 z-seksyon (B) oubyen en zimaz emisfer selil 3D bann marker kargezon ek ERES (C). bar 1μm (A ek B). younit lanpler i 0.551μm (C). Gas1-GFP ti ganny detekte dan bann rezyon oubyen groupman ER separe, tandis ki Mid2-iRFP ti ganny detekte e distribye atraver manbràn ER (C). (D) Graf i montre lentansite fluoresans relatif Gas1-GFP ek Mid2-iRFP dan group Gas1-GFP lo laliny fles blan (gos). AU, younit arbitrer. (E ek F) i reprezant sa zimaz 3D ki konbin bann marsandiz ek mark ERES. bann group Gas1-GFP ti ganny detekte obor ERES spesifik. younit lanpler i 0.551μm. (F) Sa fles solid blan i mark sa group Gas1-GFP ki asosye avek ERES. bann pano milye ek kote drwat i montre sa zimaz 3D agrandi e en vi vire sa group Gas1-GFP selekte.
relasyon spasyal pros ant sa group Gas1-GFP ek en ERES spesifik i endike ki Gas1-GFP i kapab antre dan ERES selektif, ki diferan avek selektivite ki Mid2-iRFP i servi pou kit ER. pou adres sa posibilite, nou ti kantifye rapor ERES pou zis enn ou de marsandiz (Figure 2, A to C). nou'n trouve ki laplipar ERES (70%) i annan zis en kalite kargezon. Zimaz anba dan Fig 2C i montre de legzanp tipik ERES avek zis Gas1-GFP (Figure 1) oubyen zis Mid2-iRFP (Figure 2). par kont, apepre 20% ERES i kontenir de kargezon ki sirkile dan menm landrwa. I ti ganny trouve ki serten ERES (10%) ti annan de kalite kargezon, me zot ti ganny izole dan bann landrwa klerman diferan. Alor, sa analiz statistik i montre ki apre ki ER in ganny eksporte, GPI-AP Gas1-GFP ek transmembrane cargo Mid2-iRFP i ganny divize an diferan ERES (Figure 2D). sa lefikasite triyaz i tre konsistan avek analiz biosimik presedan (6) e determinasyon morfolozik (7). nou kapab osi obzerv konportman kargezon an karantenn ki pe antre dan ERES (Figure 2E ek Film S2). Fig 2E i montre ki zis en pti porsyon Gas1-GFP (panel 3) oubyen Mid2-iRFP (panel 4) ki antre dan ERES lo en kote e i ganny konfine dan en landrwa separe. Panel 5 dan Fig 2E i montre ki Gas1-GFP ek Mid2-iRFP i parfwa ganny trouve dan menm ERES, me zot antre lo diferan kote e zot ganny konsantre dan bann rezyon separe ki kapab reprezant diferan vezikil COPII. Nou ti osi konfirmen ki separasyon obzerve e klasifikasyon C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 koman ERES selektif i spesifik akoz en lot kargezon sekresyon transmembrane, GFP-tagged plasma membrane protein Axl2 (27 ), ki montre en konportman parey avek Mid2-iRFP. (portre S1 ek film S3). Axl2-GFP ki fek ganny sentetik i ganny distribye atraver manbràn ER parey Mid2-iRFP (Figure S1, A ek B), e i ganny ko-lokalize avek Mid2-iRFP dan laplipar ERES (Figure S1, B ziska D). Panel 1 ek 2 dan Fig 1. S1C i montre de legzanp tipik ERES kot de kargezon transmembrane i sirkile. dan sa bann ka, tou le de marsandiz i antre dan ERES ansanm (Figure S1E, Panel 3 ek Movie S3).
bann selil sec31-1 ki eksprim bann sekresyon galaktoz, Gas1-GFP (GPI-AP, ver) e Mid2-iRFP (TMP, ble) e ERES konstititiv ki pe marke Sec13-mCherry (ERES, magenta) ti ganny mete a 37 Apre enkubasyon pou 30 minit a °C, 24 °C, ionn ganny large, e blok ion avek SCLIM apre 20 minit. (A ziska C) Zimaz prozeksyon 2D reprezantatif (A; bar lanpler, 1μm) oubyen zimaz emisfer selil 3D (B ek C; younit lanpler, 0.456μm) kargezon ek 10 z-seksyon marke par ERES. Panel pli ba dan (B) e pano dan (C) i montre bann zimaz ki'n ganny prosese pou montre zis bann marsandiz prezan dan ERES (mazenta) [Gas1-GFP (gri) ek Mid2-iRFP (ble kler)]. (C) fles ouver: ERES i anmenn zis en morso kargezon (1 a 4). fles gri: ERES i konteni kargezon separe (5). Fles solid blan: ERES ki konteni kargezon ki'n ganny lokalize ansanm. Anba: Sa ERES tousel ki'n ganny selekte i annan zis Gas1-GFP (1) oubyen Mid2-iRFP (2). bar lanpler, 100 nm. (D) Kantifikasyon sa fotomikrograf ki'n ganny dekrir dan (C). poursantaz mwayenn ERES ki annan zis en kargezon (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP), kargezon segrege e kargezon ki sirkile. dan trwa eksperiman endepandan, n=432 dan 54 selil. bar lerer = SD. tes t san per de kote. *** P = 0.0002. (E) Zimaz 3D bann ERES selekte bann kargezon an karantenn marke avek (C). Gas1-GFP (ver) (3) oubyen Mid2-iRFP (ble) (4) i antre dan ERES (magenta) lo en kote e i ganny restrikte a en pti landrwa dan ERES. Parfwa, tou le de kalite kargezon i antre dan menm ERES (5) lo menm kote e i ganny limite dan en landrwa izole dan ERES. bar lanpler, 100 nm.
apre, nou ti teste en ipotez ki long lasenn acyl ceramide (C26) prezan dan manbràn ER i diriz groupman spesifik e triyaz Gas1 dan ERES selektif. Pour sa bi, nou ti servi en souch lelven modifye GhLag1, dan lekel sa de sintaz seramid endozenn Lag1 ek Lac1 ti ganny ranplase par GhLag1 (omolog Lag1 koton), ki ti an rezilta en souch lelven avek en souch manbràn selil Ceramide pli kourt ki kalite sovaz (Figure 3A) (28). analiz spektrometri mas (MS) ti montre ki dan bann souch sovaz, 95% total seramid i tre long (C26) lasenn seramid, tandis ki dan GhLag1, 85% seramid i tre long (C18 ek C16). ), zis 2% ceramide i tre long (C26) lasenn ceramide. Malgre ki bann seramid C18 ek C16 i bann seramid prensipal ki'n ganny detekte dan manbràn GhLag1 ziska prezan, analiz MS in osi konfirmen ki lank GPI Gas1-GFP ki'n ganny eksprimen dan souch GhLag1 i kontenir seramid C26, ki konparab avek bann lipid kalite sovaz. kalite i parey (Fig. 3A) (26). Alor, sa i vedir ki lanzim remodeling seramid Cwh43 i tre selektif pour seramid C26, parey i ganny montre dan Fig 26, i preferansyelman enkorpor lank GPI sorti dan en pti kantite seramid C26 dan souch GhLag1. S2 (29). kantmenm, manbràn selil GhLag1 i basically annan zis C18-C16 ceramide, tandis ki Gas1-GFP i ankor annan C26 ceramide. sa fe i fer sa strain en zouti ideal pou spesifikman rezourd problenm longer lasenn acyl dan membrane ceramide dan ER. rol ipotetik laklas ek triyaz. Apre, nou ti premyerman etidye abilite C26 Gas1-GFP pou akimile dan bann group dan GhLag1 avek en alel mitan sansib a tanperatir sec31-1 atraver mikroskopi fluoresans konvansyonnel, kot zis lasenn long (C18-C16) ki egziste dan manbràn ER Ceramide (Fig. 3). nou ti obzerve ki dan sec31-1, laplipar Gas1-GFP ti ganny konsantre dan bann group, tandis ki Gas1-GFP dan sec31-1 GhLag1 avek long (C18-C16) long manbràn seramid ER pa ti prensipalman groupe e distribye dan Dan manbràn ER antye. pou vin presi, akoz C26 ceramide-based clustering i pros avek ERES spesifik (Figure 1), nou ti apre fer en lenvestigasyon si sa prosesis i kapab osi enplik fonksyon mekanizm protein eksportasyon ER. GPI-AP i servi en sistenm COPII spesyal pou leksportasyon ER, ki ganny aktivman regle par remodel striktirel Ted1 dan porsyon glycan dan lank GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan i apre ganny rekonnet par konpleks resepter kargo transmembrane p24, ki an retour i rekrit Lst1 dan en fason selektif, ki en izoform spesifik sa sou-unit kargo COPII mazer Sec24, ki form en COPII ris an GPI-AP Vesikil i neseser (31-33). Alor, nou ti konstrir en doub mitan ki ti konbin delesyon sa bann protein tousel (konponan konpleks p24 Emp24, lanzim remodeling GPI-glikan Ted1 e sou-unit COPII spesifik Lst1) avek souch mitan sec31-1, e etidye zot Eski i posib pou form Gas1-Gluster GFP (Figure 3). nou'n obzerve ki dan sec31-1emp24Δ ek sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP i prensipalman san groupman e distribye atraver manbràn ER, parey in deza ganny vwar dan sec31-1 GhLag1, tandis ki dan sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP parey sec31-11. Sa bann rezilta i endike ki an plis ki prezans C26 ceramide dan manbràn ER, groupman Gas1-GFP i osi bezwen atase avek konpleks p24, e pa demann rekritman Lst1 spesifik. Apre, nou ti eksplor posibilite ki longer lasenn seramid dan manbràn ER i kapab regle lyezon Gas1-GFP avek p24. Sepandan, nou'n trouve ki prezans C18-C16 ceramide dan manbràn pa afekte bann GPI-glycans rekonstrir par konpleks p24 (Zis S3 ek S4, A ek B) oubyen atase avek GPI-AP e eksport GPI-AP. abilite. rekrit COPII sou-tip Lst1 (Figure S4C). Alor, C26 ceramide-dependent clustering pa demann enteraksyon protein avek diferan mekanizm protein eksportasyon ER, me i siport en mekanizm triyaz alternativ ki ganny dirize par longer lipid. apre, nou ti analize si longer lasenn asil ceramide dan manbràn ER i enportan pou klasifikasyon efektiv Gas1-GFP koman ERES selektif. Vi ki Gas1 dan souch GhLag1 avek seramid lasenn kourt i kit ER e antre dan manbràn plasma (Figure S5), nou krwar ki si triyaz i ganny dirize par longer lasenn asil seramid, Gas1 dan souch GhLag1 i kapab ganny rediriz e krwaze. bann marsandiz ERES avek menm manbràn.
(A) Manbràn selil GhLag1 i prensipalman kontenir bann seramid C18-C16 pli kourt, tandis ki lank GPI Gas1-GFP i ankor annan menm C26 IPC ki bann selil sovaz. Anler: analiz longer lasenn asil seramid dan manbràn selil bann souch sovaz (Wt) ek GhLag1p par spektrometri mas (MS). lenformasyon i reprezant poursantaz seramid total. mwayenn trwa eksperiman endepandan. bar lerer = SD. tes t san per de kote. **** P ＜0.0001. Panel anba: analiz MS lo longer lasenn asil IPC prezan dan lank GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) eksprimen dan bann souch wild-type ek GhLag1p. lenformasyon i reprezant poursantaz sinyal IPC total. mwayenn senk eksperiman endepandan. bar lerer = SD. tes t san per de kote. ns, pa enportan. P = 0.9134. (B) bann mikrograf flworesans bann selil sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ ki ti pe eksprim Gas1-GFP ki ti ganny enfliyanse par galaktoz ti ganny enkile a 37°C pou 30 minit e ti ganny performen pou bann routin fluoresans mikroskopi apre 24°C. Fles blan: ER Gas1-GFP cluster. Fles ouver: Gas1-GFP ki pa'n ganny groupe i ganny distribye lo manbràn ER antye, ki montre kolorasyon bag nikleer karakteristik ER. bar lanpler, 5μm. (C) Kantifikasyon sa fotomikrograf ki'n ganny dekrir dan (B). poursantaz mwayenn bann selil avek striktir Gas1-GFP. dan trwa eksperiman endepandan, n≥300 selil. bar lerer = SD. tes t san per de kote. **** P ＜0.0001.
pou rezourd sa problenm direkteman, nou ti fer vizyalisasyon SCLIM Gas1-GFP ek Mid2-iRFP dan GhLag1 avek alel mitan sansib a tanperatir sec31-1 (Figure 4 ek Film S4). Apre ki ER ti ganny retenir a 37°C e apre ganny large a 24°C, laplipar Gas1-GFP ki ti'n fek ganny sentetik pa ti ganny groupe e distribye atraver manbràn ER, parey in ganny obzerve par bann mikroskop konvansyonnel (Figure 4, A ek B ). an plis, en gran poursantaz ERES (67%) i enkli de kalite kargezon ki ko-lokalize ladan (Figure 4D). Panel 1 ek 2 dan Fig 4C i montre de legzanp tipik ERES avek Gas1-GFP ek Mid2-GFP ki sirkile. an plis, tou le de marsandiz ti ganny rekrit dan menm ERES (Figure 4E, panel 3 ek film S4). Alor, nou bann rezilta i endike ki longer lasenn asil seramid dan manbràn ER i en determinan enportan dan agregasyon ek klasifikasyon protein ER.
bann selil Sec31-1 GhLag1 ki eksprim bann sekresyon endwir par galaktoz, Gas1-GFP (GPI-AP, ver) e Mid2-iRFP (TMP, ble) e konstititiv ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) Enkubasyon a 37°C. kontinyen pour 30 minit, desann a 24°C pour larg bann sekresyon, e zimaz avek SCLIM apre 20 minit. (A ziska C) Bann zimaz prozeksyon 2D reprezantatif (A; bar lanpler, 1μm) oubyen bann zimaz emisfer selil 3D (B ek C; younit lanpler, 0.45μm) sa 10 z-seksyon marke par kargo ek ERES. Panel pli ba dan (B) e pano dan (C) i montre bann zimaz ki'n ganny prosese pou montre zis bann marsandiz prezan dan ERES (mazenta) [Gas1-GFP (gri) ek Mid2-iRFP (ble kler)]. (C) Fles ranpli avek blan: ERES, marsandiz i sirkile. fles ouver: ERES i annan zis en item. Panel pli ba: ERES selekte i annan bann marsandiz ki sirkile (1 ek 2) marke dan (C). bar lanpler, 100 nm. (D) Kantifikasyon sa fotomikrograf ki'n ganny dekrir dan (C). dan bann younit sec31-1 ek sec31-1 GhLag1, zis en kargezon (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP) ki ganny enkli, e poursantaz mwayenn ERES pour kargezon izole e kargezon ki sirkile. dan trwa eksperiman endepandan, n = 432 dan 54 selil (sec31-1) e n = 430 dan 47 selil (sec31-1 GhLag1). bar lerer = SD. tes t san per de kote. *** P = 0.0002 (sec31-1) e ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Zimaz 3D ERES selekte avek kargezon ki sirkile (3) marke dan (C). Gas1-GFP (ver) ek Mid2-iRFP (ble) i apros ERES (magenta) lo menm kote e reste dan menm landrwa restrikte ERES. bar lanpler, 100 nm.
Sa letid i donn levidans direk in vivo ki bann kargezon protein baze lo lipid i ganny klasifye dan bann sit eksportasyon selektif dan semen sekreter, e i revel lenportans longer lasenn asil pou selektivite klasifikasyon. An servan en teknik mikroskopi pwisan e avangard ki apel SCLIM, nou'n demontre nouvo Gas1-GFP ki'n ganny sentetize (en GPI-AP mazer dan manbràn plasma avek en porsyon lipid seramid lasenn asil (C26) tre long) dan lelven) bann rezyon ki'n ganny groupe dan bann ER diskre i asosye avek ERES spesifik, anmenmtan ki bann protein transmembran i ganny sekrete atraver manbràn ERRES (Figure 1). an plis, sa de kalite marsandiz i antre dan diferan ERES selektivman (Figure 2). longer lasenn asil seramid seliler dan manbràn i redwir sorti C26 ziska C18-C16, groupman Gas1-GFP i ganny deranze dan rezyon ER diskre, e Gas1-GFP i ganny re-route pou kit ER avek protein transmanbràn atraver menm ERES (Figure 3 ek Figure 3). 4).
Malgre ki GPI-AP i servi en mekanizm protein spesyalize pou sorti dan ER, nou'n trouve ki separasyon depandan lo ceramide C26 pa depan lo bann enteraksyon protein diferansyel ki kapab anmenn ver spesyalizasyon ERES (Zis S4 ek S5). o kontrer, nou bann konklizyon i siport en mekanizm klasifikasyon alternativ ki ganny dirize par groupman protein baze lo lipid e eksklizyon lezot kargo ki swiv. Nou bann lobzervasyon i endike ki rezyon Gas1-GFP oubyen groupman asosye avek en ERES spesifik i mank protein Mid2-iRFP ki ganny sekrete par transmembrane, ki endike ki groupman GPI-AP ki depan lo ceramide C26 pou fasilit zot larantre dan ERES relevan, e anmenmtan, eksklir transmembrane Bann sekresyon i antre dan sa ERES partikilye (Figure 2 ek ERES). par kont, prezans bann seramid C18-C16 dan manbràn ER pa fer GPI-AP form bann rezyon oubyen bann group, alor zot pa eksklir oubyen ranplas bann protein sekrete par manbràn dan menm ERES (Zis 3 ek 4). . Alor, nou propoze ki C26 ceramide i diriz separasyon ek klasifikasyon par fasilit groupman bann protein ki relye avek ERES spesifik.
ki mannyer pou akonplir sa C26 ceramide-dependent clustering dan en landrwa spesifik ER? tandans seramid manbràn pou separe lateralman i kapab fer GPI-AP ek seramid C26 form bann lipid pti e enstantaneman dan lanvironnman lipid pli iregilye dan manbràn ER ki kontenir bann gliserolipid pli kourt e ensatire. bann group kalite (17, 18). Sa bann pti group tanporer i kapab ganny fizyonnen dan bann pli gran group pli stab apre ki zot in atase avek konpleks p24 (34). Konsistan avek sa, nou'n montre ki C26 Gas1-GFP i bezwen enterakte avek konpleks p24 pou form bann pli gran group vizib (Figure 3). Konpleks p24 i en oligomer eterozigot konpoze avek kat diferan protein transmembrane p24 dan lelven (35), ki fourni lyezon miltivalan, ki kapab anmenn ver cross-linking bann pti group GPI-AP, e par sa prodwir en pli gran group stab (34). enteraksyon ant bann ektodomenn protein GPI-AP i osi kapab kontribye dan zot agregasyon, parey in ganny montre pandan zot transpor Golgi dan bann selil epitelyal polarize mamifer (36). Sepandan, ler C18-C16 ceramide i prezan dan manbràn ER, ler konpleks p24 i atase avek Gas1-GFP, bann gran group separe pa pou ganny formen. mekanizm sous-jasan i kapab depan lo bann propriyete fizik e simik spesifik sa long lasenn asil ceramide. bann letid biofizik lo bann manbràn artifisyel i montre ki malgre ki tou le de long (C24) e kourt (C18-C16) seramid lasenn asil i kapab koz separasyon faz, zis bann seramid lasenn asil long (C24) ki kapab promot en o Kourb ek kourb film pou reform sa film. atraver referans mityel (17, 37, 38). in ganny demontre ki transmembrane helix TMED2, omolog imen Emp24, i enterakte selektivman avek sphingomyelin baze lo seramid C18 dan bann lobil sitoplazmik (39). An servan bann similasyon dinamik molekiler (MD), nou'n trouve ki tou le de seramid C18 ek C26 i akimile otour bann lobil sitoplasmik dan helix transmembrane Emp24, e zot annan bann preferans parey (Figure S6). I bon note ki sa i endike ki sa helix transmembrane Emp24 i kapab anmenn en distribisyon asimetrik bann lipid dan sa manbràn. sa i en rezilta resan baze lo bann selil mamifer. bann similasyon MD parey i osi montre prezans bann lipid eter (40) . Alor, nou pe spekile ki C26 ceramide dan sa de lobule ER26 i ganny anrisir lokalman. ler GPI-AP dan bann lobil liminal i direkteman atase avek p24 miltivalan e akimilasyon C26 ceramide otour p24 dan bann lobil sitoplazmik, i kapab promot agregasyon protein ki akonpanny e kourb manbràn i ganny zenere atraver bann ledwa (41), ki fer GPI-AP separe dan bann rezyon diskre obor bann rezyon ERES, ki osi favoriz bann rezyon kourb o manbràn ER (42). bann rapor presedan ti siport mekanizm ki ti ganny propoze (43, 44). lyezon miltivalan bann oligolektin, patozenn oubyen antikor avek glikosfingolipid baze lo seramid (GSL) lo manbràn plasma i deklans en gran agregasyon GSL, i amelyor separasyon faz e koz deformasyon ek enternalizasyon manbràn (44). Iwabuchi eksetera. (43) I ti ganny trouve ki dan prezans bann long (C24) me pa kourt (C16) lasenn asil, sa ligand miltivalan ki ti atase avek GSL lactosylceramide ti ensit formasyon bann gran group e lenvazinasyon manbràn, e transdiksyon sinyal sitoplasm Lyn-medye lo bann fey i ganny enterdize par bann lasenn neutrophils dan bann koup neutrofil.
dan bann selil epitelyal polarize bann mamifer, konsantrasyon rezo anti-Golgi (TGN) ziska nivo manbràn plasma apikal i kontrol separasyon e triyaz GPI-AP (10, 45). sa agregasyon i ganny dirize par oligomerizasyon GPI-AP (36), me i kapab osi depan lo longer lasenn seramid ki nou trouve dan lelven. Malgre ki GPI-AP mamifer i annan en lank baze lo lipid eter, e son striktir simik i tre diferan avek lasenn asil tre long ceramide, en letid resan in trouve ki tou le de lipid i annan bann propriyete fizik e simik e fonksyon parey evolisyonnelman (40). Alor, parti lipid eter dan bann selil mamifer i kapab parey avek C26 ceramide dan lelven, e son rol se pou asosye avek ceramide long-chain dan manbràn pou promot agregasyon ek triyaz GPI-AP. Menm si sa posibilite i ankor bezwen ganny teste direkteman, bann konklizyon presedan i siport ki transpor sa long lasenn asil seramid ziska lekor Golgi pa ganny fer par bann protein transfer sitoplazmik, me i depan lo sentes bann lank GPI parey lelven. Alor, mekanizm konservativ evolisyonner i paret kapab selektivman ko-transport tre long lasenn asil ceramide ek GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dan menm vezikil transpor.
dan bann sistenm selil epitelyal polarize lelven ek mamifer, agregasyon GPI-AP e separasyon avek lezot protein manbràn plasma i arive avan ariv lo sirfas selil. Paladino ek lezot. (48) ti trouve ki lo TGN bann selil epitelyal polarize bann mamifer, groupman GPI-AP pa zis neseser pou klasifikasyon selektif bann GPI-APs dan manbràn plasma apikal, me i osi regle lorganizasyon groupman GPI-APs ek son aktivite biolozik. sirfas selil. dan lelven, sa letid in montre ki group GPI-AP ki depan lo C26 ceramide lo ER i kapab regle lorganizasyon group e aktivite fonksyonnel GPI-AP lo manbràn plasma (24, 49). Konsistan avek sa model, bann selil GhLag1 i alerzik avek bann inhibiter GPI oubyen bann latizann ki afekte lentegrite miray selil (28), e nesesite pour bann groupman fonksyonnel Gas1-GFP (49) bann bout seramid ki ganny prozekte dan akoupman bann selil lelven i endike G� bann konsekans fizyolozik posib bann selil hLag1. lerer GPI-AP. Sepandan, plis teste si lorganizasyon fonksyonnel sirfas selil in ganny progranmen sorti kot ER par en metod triyaz baze lo longer lipid pou size nou resers a lavenir.
bann souch Saccharomyces cerevisiae ki'n ganny servi dan sa travay i ganny liste dan latab S1. bann souch MMY1583 ek MMY1635 SCLIM pou zimaz bann selil vivan ti ganny konstrir dan fon W303. Sa bann souch ki eksprim Sec13-mCherry avek en tag protein fluoresan ti ganny konstrir an servan en metod baze lo reaksyon an lasenn polimeraz (PCR) avek plasmid pFA6a koman en model (23). sa souch ki eksprim Mid2-iRFP ki'n ganny marke avek protein fluoresan anba kontrol promoter GAL1 ti ganny konstrir konm swivan. lanplifikasyon PCR sekans iRFP-KanMx sorti dan vekter pKTiRFP-KAN (kado E. O'Shea, nimero plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; idantifikasyon resours resers (RRID): Addgene_64687) E inserte dan Ctermind endogeneus 22. Apre ki sekans zenom Mid2-iRFP ti ganny anplifye e klone dan promoter GAL1, i ti ganny entegre dan sit Not I-Sac I plasmid lentegrasyon pRS306. plasmid pRGS7 ki ti rezilta ti ganny linearize avek Pst I pou entegre dan locus URA3.
Zenn fizyon Gas1-GFP i ganny eksprimen anba kontrol promoter GAL1 dan plasmid santromer (CEN), ki ganny konstrir konm swivan. Sekans Gas1-GFP ti ganny anplifye par PCR sorti dan plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (kado L. Popolo) e klone dan sit Xma I–Xho I plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (kado C). Miller; nimero plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). plasmid ki ti rezilta ti ganny apele pRGS6. Zenn fizyon Axl2-GFP i osi ganny eksprimen anba kontrol promoter GAL1 vekter pBEVY-GL LEU2, e son konstriksyon i konm swivan. Sekans Axl2-GFP ti ganny anplifye sorti dan plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) par PCR, e klone dan sit Bam HI-Pst I dan vekter pBEVY-GL LEU2. plasmid ki ti rezilta ti ganny apele pRGS12. sekans bann oligonukleotid ki'n ganny servi dan sa letid i ganny liste dan latab S2.
sa souch ti ganny konplemante avek 0.2% adenine ek 2% glikoz [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] ris yeast extract protein p (YP) medium (1 % Yeast extract ek 2% protein ept). (YPR)] oubyen 2% galaktoz [YP-galaktoz (YPG)] koman en sours karbonn, oubyen dan en medyom minimonm sentetik (0.15% baz azot lelven e 0.5% silfat amonyom) pou konplemant bann asid amine apropriye e baz neseser pou nitrisyon, e ki annan 2% glukoz (medyom glukoz) oubyen medyom minimonm galaktoz (mwayen galaktoz minimonm sentetik) koman en sours karbonn.
Pour zimaz an tan-reel, bann selil mitan sec31-1 ki sansib a tanperatir ki pe eksprim konstriksyon anba promoter GAL1 ti ganny kiltive dan medyonm YPR a 24°C pandan lannwit ziska faz mid-log. Apre endiksyon dan YPG a 24°C pou 1 erdtan, bann selil ti ganny enkile dan SG a 37°C pou 30 minit, e apre transfer a 24°C pou ganny large dan blok sekresyon. Concanavalin A ti ganny servi pou aranz bann selil lo en glisad an ver e zimaz par SCLIM. SCLIM i en konbinezon mikroskop fluoresans ranverse Olympus IX-71 e lenz delwil louvertir nimerik UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), skaner konfokal disk vire o-vites e o rapor sinyal-a-briye (Yokogawa Electric), spektromet personnalize, sistenm entans ek entans zimaz The (Hamamatsu Photonics) i kapab fourni en sistenm loup avek en magnifye final ×266.7 e en kamera laparey avek sarz ki miltipliy bann electron (Hamamatsu Photonics) (21). akizisyon zimaz i ganny fer par en lozisyel personnalize (Yokogawa Electric). Pour bann zimaz 3D, nou ti servi en aksyonner piezoelektrik ki ti'n ganny fer lo personnaliz pour vibre lenz obzektif vertikalman, e kolekte bann parti optik 100 nm apar dan en pil. Zimaz Z-stack i ganny konverti an lenformasyon voxel 3D, e fonksyon propagasyon pwen teorik ki ganny servi pour mikroskop konfokal disk vire i ganny servi pour prosesis dekonvolisyon par lozisyel Volocity (PerkinElmer). An servan lozisyel Volocity pou otomatikman threshold pou analiz ko-lokasyon, ERES enkli kargezon ti ganny mezire. analiz line scan ti ganny fer an servan lozisyel MetaMorph (Molecular Devices).
servi lozisyel GraphPad Prism pou determin sinifikasyon statistik. Pour t-test Student's two-tailed e tes ordiner one-way analysis of variance (ANOVA), diferans ant bann group i ganny konsidere koman annan en lenpak enportan lo P <0.05 (*).
Pour mikroskopi fluoresans Gas1-GFP, bann selil faz log ti ganny kiltive pandan lannwit dan YPD e kolekte par santrifigasyon, lave de fwa avek saline tampon fosfat, e enkile lo ice pour omwen 15 minit, e apre kontinyen anba mikroskop parey in ganny dekrir oparavan Tyek (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 delwil PH3 CS) ekipe avek en lenz obzektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu e lozisyel Application Suite X (LAS X) ti ganny servi pou akizisyon. .
bann lesantiyon ti ganny denatire avek SDS sample buffer a 65°C pou 10 minit, e apre separe par SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). pou analiz immunoblotting, 10 μl lesantiyon ti ganny mete par lane. Antikor primer: Servi anti-Gas1 poliklonal lapen a en dilye 1:3000, anti-Emp24 poliklonal lapen a en dilye 1:500, e anti-GFP poliklonal lapen (en kado sorti kot H. Riezman) a en dilye 1:3000. antikor monoklonal anti-Pgk1 sourit ti ganny servi a en dilye 1:5000 (en kado sorti kot J. de la Cruz). Antikor segonder: Horseradish peroxidase (HRP) konzige kabri anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) ki ganny servi a en dilye 1:3000 (Pierce). HRP-conjugated goat anti-mouse IgG ti ganny servi a en dilye 1:3000 (Pierce). Zonn larepons iminiter ti ganny obzerve par metod chemiluminescence reaktan SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
parey in ganny dekrir dan (31), en eksperiman imunopresipitasyon natirel ti ganny fer lo sa fraksyon ER anrisir. an bref, lav bann selil lelven avek tampon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ek melanz inhibiter proteaz) a 600 nm (OD600) a 100 dansite optik de fwa. i ti ganny kase avek bann perl an ver, e apre bann debri selil ek bann perl an ver ti ganny retire par santrifigasyon. sa sipernatan ti apre ganny santrifize a 17,000 g pou 15 minit a 4°C. sa pelet ti ganny resuspend dan TNE e digitalis saponin ti ganny azoute a en konsantrasyon final 1%. sa sispansyon ti ganny enkile pour 1 erdtan avek rotasyon a 4°C, e apre bann konponan ensolib ti ganny retire par santrifigasyon a 13,000 g a 4°C pour 60 minit. Pour iminopresipitasyon Gas1-GFP, premyerman pre-enkubasyon lesantiyon avek bann perl agaroz vid (ChromoTek) a 4°C pour 1 erdtan, e apre enkubasyon avek GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pour 3 erdtan. bann perl iminopresipite ti ganny lave senk fwa avek TNE ki ti annan 0.2% digoxigenin, elye avek SDS sample buffer, separe lo SDS-PAGE, e analize par immunoblotting.
parey in ganny dekrir dan (31), determinasyon cross-linking ti ganny fer lo sa fraksyon ER anrisir. Brefman, fraksyon ER anrisir ti ganny enkile avek 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). reaksyon crosslinking ti ganny tennyen par azout glycine (50 mM konsantrasyon final, 5 minit, 20°C).
parey in ganny dekrir oparavan (50), analiz MS lo ceramide dan bann souch sovaz ek GhLag1 ti ganny fer. an bref, bann selil ti ganny grandi ziska faz eksponansyel (3 a 4 younit OD600/ml) dan YPD a 30°C, e 25×107 selil ti ganny rekolte. zot metabolism i ganny tennyen avek lasid trikloroasetik. servi solvan lekstraksyon [etanol, delo, eter, piridin ek 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ek 1.2 nmol standar entern C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kalite). servi reaktan monometilamin [methanol, delo, n-butanol ek solisyon metilamin (4:3:1:5 v/v)] pou fer en idroliz alkalin modere lo sa ekstrak, e apre servi n-butanol satire avek delo pou desel. Finalman, sa ekstrak ti ganny resuspend dan en solvan mod pozitiv [kloroform/metanol/delo (2:7:1) + 5 mM asetat ammonium] e enzekte dan spektrometr mas. monitoring milti-reaksyon (MRM) ti ganny fer pou idantifikasyon e kantite bann molekil sphingolipid. Spektrometr mas quadrupole tersyer TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) i ekipe avek en sours ion nanoflow robotik Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pou analiz lipid. lenerzi kolizyon i ganny optimize pou sak kategori seramid. lenformasyon MS ti ganny obtenir dan en mod pozitiv. Pour sak replika biolozik, sinyal lipid i medyan trwa mezir endepandan.
parey in ganny dekrir dan (31), bann selil (800×107) ki ti pe eksprim Gas1-GFP ti ganny soumet avek iminopresipitasyon natirel. Gas1-GFP pirifye ti ganny separe par SDS-PAGE e transfer dan en manbràn polyvinylidene fluoride (PVDF). protein ti ganny vizyalize par kolorye PVDF avek amide nwanr. band Gas1-GFP ti ganny koupe dan PVDF e lave 5 fwa avek methanol e en fwa avek delo grad kromatografi likid-MS (LC-MS). par enkubasyon sa band manbràn avek 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), tampon ek 500μl melanz nitrit sodyum 1 M ki'n fek fonn a 37°C pou 3 erdtan, sa fraksyon lipid i ganny large sorti dan Gas1-GFP e i ganny lysed Release of innophoosine in glutecomycodeit and ceramiodeit (51). apre sa, sa band manbràn ti ganny lave kat fwa avek delo grad LC-MS, sek a tanperatir lasanm, e stoke dan en latmosfer azot a -80°C ziska analiz. koman en kontrol, en lesantiyon vid manbràn PVDF ti ganny servi pou sak eksperiman. lipid ki ti ganny tire dan Gas1-GFP ti apre ganny analize par MS parey in ganny dekrir (50). an bref, bann strip PVDF ki ti annan GPI-lipid ti ganny resuspend dan 75μl solvan moul negativ [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] e ti pas electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). dan sa ka, lenformasyon MS ti ganny obtenir dan mod ion negativ.
parey in ganny mansyonnen pli boner, porsyon lipid dan lank GPI ti ganny separe avek [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). bann lipid ti ganny separe par kromatografi kous mens an servan en sistenm solvan (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) e vizyalize an servan FLA-7000 (Fujifilm).
bann selil ki ti pe eksprim Gas1-GFP (600×107) ti ganny lave de fwa avek TNE buffer avek TNE buffer, e kase avek bann perl an ver, e apre santrifize pou retir bann debri selil ek bann perl an ver. sa sipernatan ti apre ganny santrifize a 17,000 g pou 1 erdtan a 4°C. sa pelet ti ganny lave dan TNE e enkile avek 1 U PI-PLC (Invitrogen) dan TNE ki ti annan 0.2% saponin digitalis pou 1 erdtan a 37°C. apre tretman lanzim, sa manbràn ti ganny retire par santrifigasyon a 17,000 g a 4°C pou 1 erdtan. pou iminopresipit Gas1-GFP, sa sipernatan ti ganny enkile avek GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pandan lannwit. Gas1-GFP pirifye separe par SDS-PAGE ti ganny kolore avek ble briyan Coomassie. band kolorasyon Gas1-GFP ti ganny koupe avek gri otour akeduk, e apre alkylation avek iodoacetamide e rediksyon avek dithiothreitol, dizesyon dan gel avek trypsin ti ganny fer. ekstrer e sek bann peptid triptik ek bann peptid avek GPI-glycans. sa peptid sek ti ganny fonn dan 20 μl delo. enzekte en porsyon (8μl) dan LC. En kolonn octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; dyamet entern 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Zapon) ti ganny servi pou separ bann peptid anba bann kondisyon gradient spesifik. faz mobil i solvan A (0.08% lasid formik) ek solvan B (0.15% lasid formik dan 80% asetonitril). En sistenm Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ti ganny servi pou elye sa kolonn avek solvan A dan 55 minit a en debi 50 μl min-1 pou 5 minit, e apre konsantrasyon solvan B ti ganny ogmante a 40%. , Leta Zini). Sa elyate ti ganny kontinyelman entrodwir dan sours ion ESI, e bann peptid triptik ek bann peptid avek GPI-glikan ti ganny analize par LTQ Orbitrap XL (spektrometr mas trap-orbitrap ion linear ibrid; Thermo Fisher Scientific). dan laranzman MS, voltaz sours kapiler ti ganny mete a 4.5 kV, e tanperatir kapiler transfer ti ganny garde a 300°C. tansyon kapiler ek tansyon lens tiyo ti ganny mete a 15 V ek 50 V, respektivman. Lenformasyon MS ti ganny obtenir dan mod ion pozitiv (rezolisyon 60,000; presizyon mas 10 parti par milyon) dan en ranze mas 300/m/z rapor mas/sarz (m/z) 3000. Lenformasyon MS/MS i ganny obtenir atraver latrap ion dan Orbit LTQ [XL] ki lenformasyon premyerman depan lo bann sif disosyasyon koze par kolizyon (CID)].
bann similasyon MD ti ganny fer an servan lozisyel GROMACS (52) e laplenn lafors MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ti apre ganny servi pou konstrir en bilayer ki ti annan dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ek Cer C18 oubyen DOPC ek Cer C26. Topolozi ek kordinasyon Cer C26 i ganny tire dan DXCE par retir bann perl an plis dan lake sphingosine. servi sa prosesis dekrir anba pou balans sa doub kous e fer li marse, apre servi bann dernyen kordinasyon sa sistenm pou konstrir en sistenm ki annan Emp24. Domenn transmembrane lelven Emp24 (rezidi 173 a 193) ti ganny konstrir koman en α-helix an servan striktir molekiler zouti vizyel MD (VMD) (58). Apre, apre ki in retir bann lipid ki ti pe sirkile, sa protein ti ganny granile gro e mete dan sa bilayer an servan CHARMM GUI. Sistenm final i kontenir 1202 DOPC ek 302 Cer C26 oubyen 1197 DOPC ek 295 Cer C18 ek Emp24. Ioniz sistenm a en konsantrasyon 0.150M. kat replika endepandan ti ganny fer pou de konpozisyon bilayer.
sa bilayer lipid i ganny balanse an servan prosesis CHARMM GUI, ki enplik minimiz e apre balans 405,000 letap, kot bann kontrent pozisyon i gradyelman redwir e eliminen, e letap letan i ganny ogmante sorti 0.005 ps pou vin 0.02 ps. apre lekilibrasyon, i prodwi 6 μs avek en letap letan 0.02 ps. Apre ki ou'n met Emp24, servi menm prosesis CHARMM GUI pou minimiz e balans sistenm, e apre tay pou 8 segonn dan prodiksyon.
Pour tou bann sistenm, pandan prosesis balansman, presyon i ganny kontrole par barostat Berendsen (59), e pandan prosesis prodiksyon, presyon i ganny kontrole par barostat Parrinello-Rahman (60). dan tou ka, presyon mwayenn i 1 bar e en skim koupling presyon semi-izotrop i ganny servi. dan prosesis balans ek prodiksyon, en termostat (61) avek rekalibrasyon vites i ganny servi pou koup tanperatir protein, lipid ek partikil solvan respektivman. pandan loperasyon antye, tanperatir targete i 310K. enteraksyon non-bonding i ganny kalkile par zener en lalis per an servan scheme Verlet avek tolerans tampon 0.005. term Coulomb i ganny kalkile an servan laplenn reaksyon e en zistans koupe 1.1 nm. term Vander Waals i servi en skim koupe avek en zistans koupe 1.1 nm, e skim koupe Verlet i ganny servi pou potansyel drift (62).
An servan VMD, longer vag koupe ant bann perl fosfat DOPC oubyen bann perl ceramide AM1 ek sa protein i 0.7 nm, e lakantite lipid ki enterakte avek sa protein i ganny kalkile. dapre sa formil swivan, kalkil fakter deplesyon-lanrisisman (DE) parey dan (63): fakter DE = (lakantite lipid total dan protein 0.7) dan protein 0.7 (lakantite Cer dan lipid total)
valer raporte i ganny obtenir koman en mwayenn, e bann bar lerer i kat kopi endepandan SE. Lenportans statistik fakter DE i ganny kalkile par t test [(averageDE-factor-1)/SE]. kalkil valer P apartir distribisyon one-tailed.
zouti GROMACS ti ganny servi pou kalkil map dansite lateral 2D sa sistenm ki konteni Emp24 dan dernyen 250 ns sa tras. pou kapab ganny map lanrisisman/deplesyon seramid, map dansite Cer i ganny divize par sonm map Cer ek DOPC, e apre divize par konsantrasyon Cer dan lekor. menm kouler map i ganny servi.
Pour bann materyo siplemanter pour sa lartik, silvouple vwar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Sa i en lartik akse ouver ki ganny distribye anba bann term Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ki permet litilizasyon, distribisyon e reprodiksyon dan nenport ki medyom, tan ki litilizasyon final pa pour benefis komersyal e premis se ki travay orizinal i korek. Referans.
Not: Nou zis demann ou pou donn ou ladres imel pou ki sa dimoun ki ou rekomande lo sa paz i konnen ki ou anvi zot vwar sa imel e ki i pa spam. nou pa pou kaptir okenn ladres imel.
sa kestyon i ganny servi pou teste si ou en viziter e anpes soumisyon spam otomatik.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Lopez (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
zimaz 3D o rezolisyon an tan reel i revel lenportans longer lasenn seramid pou triyaz protein dan bann sit sorti selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Lopez (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
zimaz 3D o rezolisyon an tan reel i revel lenportans longer lasenn seramid pou triyaz protein dan bann sit sorti selektif.
©2020 Lasosyasyon Ameriken pou Lavansman Lasyans. tou drwa rezerve. AAAS i en partener HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ek COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.