Prezan *Ladres aktyel: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Ageing Diseases (CECAD).
Nerodezenerasyon bann maladi mitokondriyal i ganny konsidere koman ireversib akoz plastisite metabolik bann neron i limite, me lefe disfonksyonnman mitokondriyal lo lotonomi selil metabolism neronal dan lekor i mal ganny konpran. La, nou entrodwir proteom spesifik selil bann neron Purkinje avek defisians OXPHOS progresiv koze par dinamik fizyon mitokondriyal enteronpe. nou'n trouve ki disfonksyonnman mitokondriyal in deklans en sanzman profon dan domenn proteomik, ki finalman in anmenn ver aktivasyon sekansyel bann progranm metabolik presi avan lanmor selil. san ekspekte, nou ti determin endiksyon evidan pyruvate carboxylase (PCx) ek lezot lanzim anti-aging ki konplemant bann entermedyer sikl TCA. lenibisyon PCx in agrav stres oksidatif ek nerodezenerasyon, ki endike ki ateroskleroz i annan en lefe proteksyon dan bann neron ki napa OXPHOS. restorasyon fizyon mitokondriyal dan bann neron ki'n dezenere terminalman i konpletman ranvers sa bann karakteristik metabolik, e alor anpes lanmor selil. nou bann konklizyon i idantifye bann semen ki oparavan enkoni ki donn rezilyans a disfonksyonnman mitokondriyal e montre ki nerodezenerasyon i kapab ganny ranverse menm dan bann staz tar sa maladi.
rol santral mitokondri dan mentenans metabolism lenerzi neron i ganny met lanfaz lo la par bann sentonm neolozik ekstansiv asosye avek bann maladi mitokondri imen. laplipar sa bann maladi i ganny koze par bann mitasyon zenn ki regle lekspresyon zenn mitokondriyal (1, 2) oubyen destriksyon zenn relye avek dinamik mitokondriyal, ki endirekteman afekte stabilite DNA mitokondriyal (mtDNA) (3, 4). travay dan bann model zannimo in montre ki an repons avek disfonksyonnman mitokondriyal dan bann tisi otour, bann semen metabolik konservativ (5-7) i kapab ganny aktive, ki donn lenformasyon enportan pou en konprenezon aprofondi lo patozenez sa bann maladi konpleks. dan en kontras, nou konprenezon lo bann sanzman metabolik bann kalite selil spesifik koze par defayans zeneral prodiksyon adenosine triphosphate (ATP) dan laservel i fondamantal (8), an mettan lanfaz lo nesesite pou idantifye bann target terapeutik ki kapab ganny servi pou anpes oubyen anpes maladi. anpes nerodezenerasyon (9). sa mankman lenformasyon i lefe ki bann selil nerf i ganny konsidere koman annan en fleksibilite metabolik tre limite konpare avek bann kalite selil dan bann tisi otour (10). Vi ki sa bann selil i zwe en rol santral dan kordinasyon prodiksyon bann metabolit pour bann neron pour promot transmisyon sinaptik e reponn a bann kondisyon blesir ek maladi, abilite pour adapte metabolism selil avek bann kondisyon defi tisi laservel i preski limite avek bann selil glial (11-14). an plis, eterozeneite seliler eneren dan tisi laservel i an gran parti anpes letid bann sanzman metabolik ki arive dan bann sou group neronal spesifik. An rezilta, napa bokou ki nou konnen lo bann konsekans egzakt seliler e metabolik disfonksyonnman mitokondriyal dan bann neron.
Pour kapab konpran bann konsekans metabolik disfonksyonnman mitokondriyal, nou ti izol bann neron Purkinje (PNs) dan diferan staz nerodezenerasyon koze par destriksyon fizyon manbràn eksteryer mitokondriyal (Mfn2). Malgre ki bann mitasyon Mfn2 dan imen i asosye avek en form neropati sansoryel moter erediter koni koman Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), destriksyon kondisyonnel Mfn2 dan bann sourit i en metod disfonksyon endiksyon oksidasyon Fosforilasyon (OXPHOS) byen rekonnet. bann diferan sou-tip neronal (16-19) e fenotip nerodezenerativ ki rezilta i ganny akonpannyen par bann sentonm nevrolozik progresiv, tel ki bann maladi mouvman (18, 19) oubyen ataksi serebeler (16). An servan en konbinezon proteomik kantitatif san etiket (LFQ), metabolomik, zimazri, e metod virolozik, nou montre ki nerodezenerasyon progresiv i fortman ensit pyruvate carboxylase (PCx) e lezot fakter enplike dan arterioskleroz bann PN in vivo Lekspresyon bann lanzim. pou verifye relevans sa konsta, nou'n spesifikman down-regulate lekspresyon PCx dan bann PN ki napa Mfn2, e nou'n trouve ki sa loperasyon in agrav stres oksidatif e akseler nerodezenerasyon, e prouve ki azoospermia i konfer lanmor selil abilite adaptasyon metabolik. lekspresyon sever MFN2 i kapab konpletman sov dezenerasyon terminal PN avek defisians sever OXPHOS, konsomasyon masiv DNA mitokondriyal, e rezo mitokondriyal aparaman kase, ki met lanfaz ankor ki sa form nerodezenerasyon i menm kapab rekipere dan staz avanse maladi avan lanmor selil.
Pour kapab vizyalize bann mitokondri dan Mfn2 knockout PNs, nou ti servi en souch sourit ki permet bann mitokondri ki depan lo Cre pour target protein zonn floresan (YFP) (mtYFP) (20) lekspresyon Cre e tyek morfolozi mitokondri in vivo. nou'n trouve ki destriksyon zenn Mfn2 dan PNs ti pou anmenn ver divizyon gradyel rezo mitokondriyal (Figure S1A), e sanzman pli boner ti ganny trouve a 3 semenn laz. par kont, dezenerasyon sibstansyel dan kous selil PN, parey i ganny demontre par pert immunostaining Calbindin, pa ti komanse ziska 12 semenn laz (Figure 1, A ek B). letan ki pa koresponn ant bann sanzman pli boner dan morfolozi mitokondriyal e komansman vizib lanmor neron ti pous nou pou fer en lenvestigasyon lo bann sanzman metabolik deklanse par disfonksyonnman mitokondriyal avan lanmor selil. Nou ti devlop en stratezi baze lo triyaz selil aktive par fluoresans (FACS) pou izol PN ki eksprim YFP (YFP+) (Figure 1C), e dan bann sourit kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ki pou ganny refer avek koman CTRL (Figure S1B). optimizasyon stratezi gating baze lo lentansite relatif sinyal YFP i permet nou pirifye lekor YFP+ (YFPhigh) bann PN sorti dan bann non-PN (YFPneg) (Figure S1B) oubyen bann fragman axon/dendritik fluoresan potatif (YFPlow; Figure S1D, gos), konfirmen par mikroskop konfokal (Figure S1D, drwat). Pour kapab verifye lidantite popilasyon klasifye, nou ti fer proteomik LFQ e apre analiz konponan prensipal, e nou ti trouve ki i annan en separasyon kler ant bann selil YFPhigh ek YFPneg (Figure S1C). bann selil YFPhigh ti montre en lanrisisman net bann marker PNs koni (ie Calb1, Pcp2, Grid2 ek Itpr3) (21, 22), me napa lanrisisman bann protein ki ganny eksprimen dan bann neron oubyen lezot kalite selil (Figure 1D) ). En konparezon ant bann lesantiyon dan bann selil YFPhigh klasifye kolekte dan bann eksperimantasyon endepandan ti montre en koefisyan korelasyon> 0.9, ki demontre en bon reprodiktivite ant bann replika biolozik (Figure S1E). an bref, sa bann lenformasyon in valid nou plan pou izolasyon akit e spesifik bann PN fezab. Akoz sistenm drayver L7-cre ki ganny servi i ensit rekombinasyon mozaik dan premye semenn apre lakousman (23), nou ti konmans touy bann sourit sorti dan CTRL e kondisyonnel (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolekte bann neron. apre ki rekombinasyon in konplete, i ganny apele Mfn2cKO a laz 4 semenn. koman pwen final, nou ti swazir 8 semenn laz ler kous PN ti entak malgre fragmantasyon mitokondriyal evidan (Figure 1B ek Figure S1A). an tou, nou ti kantifye en total 3013 protein, ladan apepre 22% ti baze lo bann lanotasyon MitoCarta 2.0 baze lo proteom mitokondriyal koman mitokondri (Figure 1E) (Figure 1E) (24). analiz diferansyel lekspresyon zenn ki ti ganny fer dan semenn 8 ti montre ki zis 10.5% tou bann protein ti annan bann sanzman enportan (Figure 1F ek Figure S1F), ladan 195 protein ti ganny down-regulate e 120 protein ti up-regulate (Figure 1F). I bon note ki “analiz semen inovativ” sa set lenformasyon i montre ki bann zenn ki ganny eksprimen dan en fason diferan i prensipalman apartenir a en set restrikte bann semen metabolik spesifik (Figure 1G). I enteresan note ki malgre ki downregulation bann semen relye avek OXPHOS ek sinyal kalsiom i konfirm endiksyon disfonksyonnman mitokondriyal dan bann PN ki napa fizyon, lezot kategori ki prensipalman enplik metabolism asid amine i ganny regle en kantite, ki anliny avek metabolism ki arive dan bann PN mitokondriyal Rewiring i konsistan. disfonksyonnman.
(A) bann portre konfokal reprezantatif bann seksyon serebeler bann sourit CTRL ek Mfn2cKO ki montre pert progresiv PNs (calbindin, gri); bann nwayo ti ganny kont-tenn avek DAPI. (B) Kantifikasyon (A) (analiz varyans en kote, ***P<0.001; n = 4 a 6 serk sorti kot trwa sourit). (C) Workflow eksperimantal. (D) Distribisyon map lasaler bann marker spesifik pour Purkinje (anler) e lezot kalite selil (milye). (E) dyagram Venn ki montre lakantite protein mitokondriyal idantifye dan PN klasifye. (F) Volkan plot bann protein diferansyelman eksprimen dan bann neron Mfn2cKO a 8 semenn (valer koupe sinifikasyon 1.3). (G) Analiz semen kreativite i montre senk semen pli enportan up-regulation (rouz) e down-regulation (ble) dan Mfn2cKO PN ki'n ganny klasifye koman 8 semenn. nivo lekspresyon mwayenn sak protein detekte i ganny montre. Map lasaler gri: valer P aziste. ns, pa enportan.
lenformasyon proteomik in montre ki lekspresyon protein bann konpleks I, III, e IV in gradyelman diminyen. Konpleks I, III, ek IV ti tou kontenir bann sou-yinite esansyel ki ti ganny kod par mtDNA, tandis ki konpleks II, ki ti selman kod par nikleer, pa ti ganny afekte (Figure 2A ek Figure S2A). . Konsistan avek rezilta proteomik, imino-isto-simi bann seksyon tisi serebeler ti montre ki nivo sou-unit MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) dan konpleks IV dan PN ti gradyelman diminyen (Figure 2B). sa sou-unit mtDNA-encoded Mtatp8 ti ganny redwir en kantite (Figure S2A), anmenmtan ki nivo steady-state sa sou-unit ATP synthase encoded par nikleer ti reste parey, ki konsistan avek sa konpleks F1 sou-asanble ATP synthase stab ki nou konnen ler lekspresyon mtDNA i stab. formasyon i konsistan. enteronp (7). evalyasyon nivo mtDNA dan bann PN Mfn2cKO ki'n ganny triye par reaksyon an lasenn polimeraz an tan-reel (qPCR) in konfirm en bes gradyel dan lakantite kopi mtDNA. Konpare avek group kontrol, a 8 semenn laz, zis apepre 20% nivo mtDNA ki ti ganny retenir (Figure 2C). Konsistan avek sa bann rezilta, kolorasyon mikroskopi konfokal Mfn2cKO PNs ti ganny servi pou detekte DNA, ki montre konsomasyon letan-depandan bann nikleotid mitokondriyal (Figure 2D). nou'n trouve ki zis serten kandida enplike dan degradasyon protein mitokondriyal e larepons stres ki ti ganny regle, enkli Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e bann fakter lasanble konpleks OXPHOS. Napa okenn sanzman enportan dan nivo protein enplike dan apoptoz ki ti ganny detekte (Figure S2B). Pareyman, nou'n trouve ki bann mitokondri ek bann kanal retikil endoplasmik ki enplike dan transpor kalsyom i annan zis bann sanzman miner (Figure S2C). an plis, evalyasyon bann protein ki relye avek otofazi pa'n trouv okenn sanzman enportan, ki konsistan avek endiksyon vizib bann otofagozom obzerve in vivo par imino-istosimi ek mikroskopi elektronik (Figure S3). Sepandan, disfonksyon progresiv OXPHOS dan PNs i ganny akonpannyen par bann sanzman mitokondriyal ultrastriktirel evidan. bann group mitokondriyal i kapab ganny vwar dan bann lekor selil e bann pye dendritik bann Mfn2cKO PNs aze 5 ek 8 semenn, e striktir manbràn enteryer in sibir bann sanzman profon (Figure S4, A ek B). Konsistan avek sa bann sanzman ultrastriktirel e en bes enportan dan mtDNA, analiz bann tranch serebral akit avek tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ti montre ki potansyel manbràn mitokondriyal dan Mfn2cKO PNs ti sifizaman diminyen (Figure S4C).
(A) Analiz parkour letan lo nivo lekspresyon konpleks OXPHOS. konsider zis bann protein avek P<0.05 a 8 semenn (two-way ANOVA). laliny pwente: napa lazisteman konpare avek CTRL. (B) Gos: En legzanp en seksyon serebeler ki'n ganny marke avek antikor anti-MTCO1 (bar mezir, 20 μm). landrwa ki ganny okipe par bann lekor selil Purkinje i kouver par zonn. Drwat: Kantifikasyon bann nivo MTCO1 (analiz varyans en kote; n = 7 a 20 selil analize sorti kot trwa sourit). (C) analiz qPCR lo nimero kopi mtDNA dan PN ki'n ganny triye (analiz varyans en kote; n = 3 a 7 sourit). (D) Gos: En legzanp en morso serebeler ki'n ganny marke avek en antikor anti-DNA (bar mezir, 20 μm). landrwa ki ganny okipe par bann lekor selil Purkinje i kouver par zonn. Drwat: Kantifikasyon bann lezyon mtDNA (analiz varyans en kote; n = 5 a 9 selil sorti dan trwa sourit). (E) En legzanp en seksyon serebeler akit ki montre bann selil mitoYFP + Purkinje (fles) dan en lanrezistreman patch clamp selil antye. (F) Kantifikasyon kourb IV. (G) Bann lanrezistreman reprezantatif pour linjeksyon kouran depolarizan dan bann selil CTRL ek Mfn2cKO Purkinje. Tras anler: Premye batman leker ki ti deklans AP. Tras anba: Frekans AP maksimonm. (H) Kantifikasyon bann input spontane postsinaptik (sPSPs). tras lanrezistreman reprezantatif ek son rapor zoom i ganny montre dan (I). analiz varyans en kote ti analiz n = 5 a 20 selil sorti dan trwa sourit. lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) bann latras reprezantatif AP spontane ki'n ganny rikorde an servan mod perforated patch clamp. tras anler: frekans AP maksimonm. tras anba: zoom en sel AP. (K) Kantifye frekans mwayenn e maksimonm AP dapre (J). tes Mann-Whitney; n = 5 selil ti ganny analize sorti kot kat sourit. lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn±SEM; pa enportan.
domaz evidan OXPHOS ti ganny detekte dan Mfn2cKO PN 8 semenn, ki endike ki fonksyon fizyolozik bann neron i severman abnormal. Alor, nou ti analiz bann karakteristik elektrik pasiv bann neron ki napa OXPHOS a 4 a 5 semenn e 7 a 8 semenn par fer bann lanrezistreman patch clamp selil antye dan bann tranch serebeler akit (Figure 2E). san ekspekte, potansyel mwayenn manbràn repo e rezistans antre bann neron Mfn2cKO ti parey avek kontrol, menm si ti annan bann diferans sibtil ant bann selil (latab 1). Pareyman, a laz 4 a 5 semenn, napa okenn sanzman enportan dan relasyon kouran-voltaz (kourb IV) ki ti ganny trouve (Figure 2F). Sepandan, okenn neron Mfn2cKO 7 a 8 semenn aze pa ti sirviv rezim IV (letap iperpolarizasyon), ki endike ki i annan en sansibilite kler pour potansyel iperpolarizasyon a sa staz tar. par kont, dan bann neron Mfn2cKO, bann kouran depolarizasyon ki koz bann desarz potansyel aksyon repetitif (AP) i ganny byen tolere, ki endike ki zot bann patern desarz an zeneral pa diferan en kantite avek bann neron kontrol 8 semenn (latab 1 ek figir 2G). Pareyman, frekans ek lanplitid bann kouran postsinaptik spontane (sPSCs) ti konparab avek sa bann dan group kontrol, e frekans bann levennman ti ogmante sorti 4 semenn ziska 5 semenn ziska 7 semenn ziska 8 semenn avek en logmantasyon parey (Figure 2, H ek I). peryod matirisyon sinaptik dan PNs (25). bann rezilta parey ti ganny obtenir apre bann plak PN perfore. sa konfigirasyon i anpes konpansasyon posib bann defo ATP seliler, parey i kapab arive dan lanrezistreman patch clamp selil antye. An partikilye, potansyel manbràn repo e frekans deklansman spontane bann neron Mfn2cKO pa ti ganny afekte (Figure 2, J ek K). an bref, sa bann rezilta i endike ki bann PN avek en disfonksyonnman evidan OXPHOS i kapab fer fas avek bann patern desarz o frekans byen, ki endike ki i annan en mekanizm konpansasyon ki permet zot mentenir bann larepons elektrofizyolozik preski normal.
lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn ± SEM (analiz varyans en kote, tes konparezon miltip Holm-Sidak; *P<0.05). nimero younit i ganny endike par braket.
nou ti deside pou fer en lenvestigasyon si okenn kategori dan dataset proteomik (Figure 1G) i enkli bann semen ki kapab kontre-azir avek defisians OXPHOS sever, e alor eksplike akoz PN afekte i kapab mentenir elektrofizyolozi preski normal (Figure 2, E ziska K). . analiz proteomik in montre ki bann lanzim enplike dan katabolizm bann asid amine lasenn branse (BCAA) ti ganny regle en kantite (Figure 3A ek Figure S5A), e prodwi final acetyl-CoA (CoA) oubyen succinyl CoA i kapab konplemant bann tricarboxylates dan arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. nou'n trouve ki konteni BCAA transaminase 1 (BCAT1) ek BCAT2 tou le de in ogmante. zot kataliz premye letap katabolism BCAA par zener glutamate sorti dan α-ketoglutarate (26). tou bann sou-yinite ki fer sa konpleks lasenn branse keto asid dehydrogenase (BCKD) i ganny regle (sa konpleks i kataliz dekarboksilasyon swivan e ireversib sa skelet karbonn BCAA ki rezilta) (Figure 3A ek Figure S5A). Sepandan, napa sanzman evidan dan BCAA limenm ki ti ganny trouve dan PN ki ti'n ganny triye, ki kapab akoz logmantasyon dan absorpsyon seliler sa bann asid amine esansyel oubyen litilizasyon lezot sours (glikoz oubyen asid laktik) pou konplemant sikl TCA (Figure S5B). PNs ki napa OXPHOS ti osi montre bann aktivite dekonpozisyon ek transaminasyon glutamine ogmante a laz 8 semenn, ki kapab ganny reflekte par up-regulation bann lanzim mitokondriyal glutaminase (GLS) ek glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A ek C). I bon note ki up-regulation GLS i limite avek spliced ​​fisoform glutaminase C (GLS-GAC) (sanzman Mfn2cKO/CTRL i apepre 4.5-fwa, P = 0.05), e son up-regulation spesifik dan bann tisi kanser i kapab siport biolenerzi mitokondriyal. (27).
(A) Map lasaler i montre sanzman pli dan nivo protein pour larout spesifye a 8 semenn. (B) legzanp en morso serebeler ki'n ganny marke avek antikor anti-PCx (bar mezir, 20 μm). sa fles zonn i montre ver lekor selil Purkinje. (C) analiz lekspresyon protein par letan idantifye koman en kandida enportan pou ateroskleroz (miltip t-test, *FDR <5%; n = 3-5 sourit). (D) Anler: En dyagram skematik ki montre bann diferan fason antre dan karbonn ki'n ganny marke dan [1-13C]tracer pyruvate (ie, atraver PDH oubyen larout trans-arteryel). Anba: Tablo vyolon i montre poursantaz karbonn avek en sel label (M1) ki'n ganny konverti an lasid aspartik, lasid sitrik e lasid malik apre ki in marke bann tranch serebeler akit avek [1-13C]pyruvate (t-test per; ** P <0.01). (E) Analiz konpreansiv listwar letan lo sa semen endike. konsider zis bann protein avek P<0.05 a 8 semenn. laliny koupe: napa valer lazisteman (analiz varyans de-fason; * P <0.05; *** P <0.001). lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn±SEM.
dan nou analiz, katabolism BCAA in vin enn bann semen kle pou up-regulation. Sa fe i fortman sizere ki volim vantilasyon ki antre dan sikl TCA i kapab sanze dan PN ki napa OXPHOS. Sa i kapab reprezant en form mazer rewiring metabolik neronal, ki kapab annan en lenpak direk lo fizyolozi neronal e sirvi pandan mentenans disfonksyonnman OXPHOS sever. Konsistan avek sa ipotez, nou'n trouve ki lanzim anti-aterosklerotik prensipal PCx i ganny regle anler (Mfn2cKO/CTRL i sanze apepre 1.5 fwa; Fig 3A), ki kataliz konversyon pyruvate an oxaloacetate (28), ki nou krwar i dan bann tisi dan laservel Lekspresyon astrocyte i ganny enfekte (29, 30). Konsistan avek rezilta proteomik, mikroskopi konfokal ti montre ki lekspresyon PCx ti spesifikman e signifikanman ogmante dan bann PN ki ti napa OXPHOS, tandis ki reaktivite PCx ti prensipalman restrikte avek bann selil glial Bergmann adjacent dan kontrol (Figure 3B). pou fonksyonnelman teste upregulation obzerve PCx, nou ti tret bann tranch serebeler akit avek [1-13C]traser pyruvate. ler pyruvate ti ganny okside par pyruvate dehydrogenase (PDH), son labek izotop ti disparet, me i ganny enkorpore dan bann entermedyer sikl TCA ler pyruvate i ganny metabolize par bann reaksyon vaskiler (Figure 3D). An sipor nou lenformasyon proteomik, nou ti obzerv en gran nonm marker sorti dan sa traser dan lasid aspartik bann morso Mfn2cKO, tandis ki lasid sitrik ek lasid malik ti osi annan en tandans modere, menm si pa ti enportan (Figure 3D).
dan bann neron dopaminn bann sourit MitoPark avek disfonksyonnman mitokondriyal koze par bann neronn dopaminn ki spesifikman detrir zenn fakter transkripsyon mitokondriyal A (Tfam) (Figure S6B), lekspresyon PCx ti osi ganny regle en kantite (31), ki endike ki larteryoskleroz asid asetonn. OXPHOS dan lekor. I bon note ki in ganny trouve ki bann lanzim inik (32-34) ki kapab ganny eksprimen dan bann neron ki kapab asosye avek arterioskleroz i ganny regle dan bann PN ki napa OXPHOS, tel ki propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA i konverti propionyl-CoA an mitoconyl-CoA e mitokondrial lanzim 3 (ME3), ki son rol prensipal se pou rekiper pyruvate sorti dan malate (Figure 3, A ek C) (33, 35). an plis, nou'n trouv en logmantasyon enportan dan lanzim Pdk3, ki fosforil e alor inaktiv PDH (36), tandis ki okenn sanzman pa ti ganny detekte dan lanzim Pdp1 ki aktiv PDH oubyen konpleks lanzim PDH limenm (Figure 3A). Konsistanman, dan Mern2cKO PNs, fosforilasyon sou-unit α1 α (PDHE1α) konponan pyruvate dehydrogenase E1 dan konpleks PDH dan Ser293 (koni pou enhibit aktivite lanzim PDH) ti ganny ranforsi (Figure S6C) (Figure S6C). pyruvate napa akse vaskiler.
Finalman, nou'n trouve ki sa siper semen biosintez serin ek glisin, sikl mitokondriyal folat (1C) e biosintez prolin (Figure 1G ek Figure S5C) i tou ganny regle en kantite, dapre bann rapor, pandan prosesis aktivasyon. bann tisi otour i ganny aktive avek disfonksyonnman mitokondriyal (5-7). analiz konfokal ki siport sa bann lenformasyon proteomik ti montre ki dan PN avek OXPHOS manke, bann morso serebeler bann sourit 8 semenn ti ganny soumet avek serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), en lanzim kle dan sikl folat mitokondriyal. Larepons iminiter enportan (Figure S5D). dan 13 tranch serebeler akit ki'n ganny enkile avek CU-glikoz, bann eksperimantasyon tras metabolik in konfirm ankor plis regilasyon biosintez serin ek prolin, ki endike ki flux bann izoform karbonn dan serin ek prolin in ogmante (Figure S5E). Vi ki bann reaksyon promouvwar par GLS ek GPT2 i responsab pour sentes glutamate sorti dan glutamine e transaminasyon ant glutamate ek α-ketoglutarate, zot upregulation i endike ki bann neron ki napa OXPHOS i annan en demann ogmante pour glutamate , Sa i kapab annan pour bi mentenir biosintez ogmante dan proline (Figure S5). Kontrerman avek sa bann sanzman, en analiz proteomik bann astrosit serebeller sorti kot bann sourit Mfn2cKO spesifik PN ti montre ki sa bann semen (enkli tou bann antiperoksidaz) pa ti sanz en kantite dan lekspresyon, e alor demontre Sa redireksyon metabolik i selektif pour PN degrade (Fig. S6, D to G).
an bref, sa bann analiz in revel bann diferan patern aktivasyon tanporel bann semen metabolik spesifik dan bann PN. Malgre ki fonksyon mitokondriyal neronal abnormal i kapab anmenn ver ateroskleroz boner e remodelasyon 1C (Figure 3E ek Figure S5C), e menm bann sanzman previzib dan lekspresyon bann konpleks I ek IV, bann sanzman dan sentes serin de novo i selman I ti vin aparan dan bann staz tar. disfonksyonnman OXPHOS (Figure 3E ek Figure S5C). Sa bann konklizyon i definir en prosesis sekansyel dan lekel larepons mitokondriyal (sik 1C) ek sitoplazmik (biosentez serin) ki ganny enfliyanse par stres i sinerzistikman avek logmantasyon dan ateroskleroz dan sikl TCA pou reform metabolism neronal.
bann PN 8 semenn ki napa OXPHOS i kapab mentenir aktivite eksitasyon o frekans e sibir en rekoneksyon metabolik enportan pou konpans disfonksyonnman mitokondriyal. sa dekouvert i lev en posibilite enteresan ki menm a sa moman, sa bann selil i kapab osi resevwar lentervansyon terapeutik pou retard oubyen anpes nerodezenerasyon. Tar. nou'n rezourd sa posibilite atraver de lentervansyon endepandan. dan premye metod, nou ti konsevwar en vekter viris asosye avek adeno (AAV) ki depan lo Cre pour ki MFN2 i kapab ganny eksprimen dan bann PN ki napa OXPHOS in vivo (Figure S7A). AAV ki ankod MFN2 e zenn raporter fluoresan mCherry (Mfn2-AAV) ti ganny verifye dan bann kiltir neron primer in vitro, ki ti fer MFN2 ganny eksprimen dan en fason depandan lo Cre e ti sov morfolozi mitokondriyal, e alor anpes neromitasyon dan bann neron Mfn2cKO (Figure S7, D, B ek D). apre, nou ti fer bann eksperimantasyon in vivo pou delivre stereotaktikman Mfn2-AAV 8 semenn dan korteks serebelyer Mfn2cKO ek bann sourit kontrol, e analiz bann sourit 12 semenn (Figure 4A). bann sourit Mfn2cKO ki ti ganny trete ti mor (Figure 1, A ek B) (16). transdiksyon viral in vivo ti an rezilta lekspresyon selektif PN dan serten serk serebeler (Figure S7, G ek H). linjeksyon kontrol AAV ki ti pe eksprim zis mCherry (Ctrl-AAV) ti napa okenn lefe signifikan lo degre nerodezenerasyon dan bann zannimo Mfn2cKO. par kont, analiz Mfn2cKOs transdwir avek Mfn2-AAV ti montre en lefe proteksyon enportan lo kous selil PN (Figure 4, B ek C). An partikilye, dansite neron i paret preski endistingab avek bann zannimo kontrol (Figure 4, B ek C, e Figure S7, H ek I). lekspresyon MFN1 me pa MFN2 i egalman efektiv dan sov lanmor neronal (Figure 4C ek Figure S7, C ek F), ki endike ki lekspresyon ektopik MFN1 i kapab efektivman konplemant mankman MFN2. Plis analiz lo nivo PN tousel ti montre ki Mfn2-AAV ti sov an gran parti ultrastriktir mitokondri, normaliz nivo mtDNA, e ranvers lekspresyon o marker anti-anzyozenez PCx (Figure 4, C to E ). lenspeksyon vizyel bann sourit Mfn2cKO ki ti ganny sove dan en leta repo ti montre ki zot postir ek sentonm moter (mouvman S1 ziska S3) ti amelyore. An konklizyon, sa bann eksperiman i montre ki re-lentrodiksyon an retar MFN2 dan bann PN ki severman defisian dan OXPHOS i sifizan pou ranvers konsomasyon mtDNA e ensit ateroskleroz, e alor anpes dezenerasyon axon e lanmor neron in vivo.
(A) En scheme ki montre progranm eksperimantal pou enzekte AAV ki ankod MFN2 ler sa semen metabolik endike i ganny aktive. (B) Bann zimaz konfokal reprezantatif bann tranch serebeler 12 semenn ki ti ganny transdwir a 8 semenn dan bann sourit Mfn2cKO e marke avek antikor anti-Calbindin. Drwat: Dekalaz bann fib axon. lanpler zoom axon i 450 e 75 μm. (C) Gos: Kantifikasyon dansite selil Purkinje dan boukl transdiksyon AAV (AAV+) (analiz varyans en kote; n = 3 sourit). Drwat: analiz focus mtDNA dan PN transdwir dan semenn 12 (t-test san per; n = 6 selil sorti dan trwa sourit). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Bann mikrograf transmisyon reprezantatif bann PN bann seksyon serebeler Mfn2cKO ki'n ganny transdwir avek bann vekter viral endike. sa mask roz i ilistre landrwa okipe par bann dendrit, e sa kare zonn pwente i ilistre zoom ki'n ganny donnen lo kote drwat; n i reprezant nwayo. bar lanpler, 1μm. (E) i montre en legzanp kolorasyon PCx dan PN transdwir a 12 semenn. bar lanpler, 20μm. OE, overexpression; FC, sanzman pliye.
Finalman, nou ti fer en lenvestigasyon lo lenportans sirvivans selil endwir par peroxidase dan bann PN ki'n eksperyans disfonksyonnman OXPHOS. nou ti zener mCherry ki ankod AAV-shRNA (short hairpin RNA) ki ti spesifikman target mRNA PCx sourit (AAV-shPCx), e enzekte viris oubyen son kontrol melanze (AAV-scr) dan serebelum bann sourit Mfn2cKO. linjeksyon ti ganny fer dan katriyenm semenn laz (Figure 5A) pou atenn en knockdown PCx efektiv pandan peryod kot lekspresyon PCx ti ogmante (Figure 3C) e kous selil PN ti ankor entak (Figure 1A). I bon note ki kraz PCx (Figure S8A) i anmenn en akselerasyon enportan dan lanmor PN, ki limite avek bag enfekte (Figure 5, B ek C). Pour kapab konpran mekanizm bann lefe metabolik ki ganny enfliyanse par PCx ​​up-regulation, nou ti etidye stati redox bann PN apre PCx knockdown e AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 ti ganny eksprimen anmenmtan (Figure S8, B to D) pour evalye glutathione Sanzman relatif dan potansyel peptide redox (883). Apre, nou ti fer mikroskopi zimaz lavi fluoresans de-foton (FLIM) dan bann tranch laservel akit Mfn2cKO 7 semenn oubyen bann littermates kontrol pou detekte bann sanzman potansyel dan stati redox sitoplazmik apre verifye bann kondisyon FLIM (Figure S8, E ziska G). analiz ti montre en logmantasyon enportan dan leta oksidasyon en sel Mfn2cKO PNs ki napa lekspresyon PCx, ki diferan avek bann neron kontrol oubyen Mfn2cKO PNs ki eksprim zis shRNA melanze (Figure 5, D ek E). ler lekspresyon PCx ti ganny regle anba, poursantaz Mfn2cKO PNs ki ti montre en leta tre okside ti ogmante par plis ki trwa fwa (Figure 5E), ki endike ki PCx up-regulation ti mentenir kapasite redox bann neron dezenere.
(A) En scheme ki montre progranm eksperimantal pou enzekte AAV ki ankod shPCx ler sa semen metabolik endike i ganny aktive. (B) Bann portre konfokal reprezantatif bann seksyon serebeler 8 semenn dan bann sourit Mfn2cKO ki ti ganny transdwir e marke avek antikor anti-kalsineurin a 4 semenn. bar lanpler, 450μm. (C) Kantifikasyon dansite selil Purkinje dan bann loop transdwir par AAV (analiz varyans en kote; n = 3 a 4 sourit). lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn±SEM; ***P<0.001. (D) Portre FLIM reprezantatif i montre lavi mwayenn PN 7 semenn ki pe eksprim sanser redox glutathione Grx1-roGFP2 anba bann kondisyon eksperimantal spesifye. LUT (look-up table) ratio: lenterval letan sirvivans (an pikosegonn). bar lanpler, 25μm. (E) Istogram i montre distribisyon bann valer lavi Grx1-roGFP2 sorti dan (D) (n=158 a 368 selil dan de sourit anba sak kondisyon). sa tablo par lao sak histogram: i montre lakantite selil avek bann valer lavi sifizaman pli long (rouz, okside) ou pli kourt (ble, redwir), ki depas 1 SD valer lavi mwayenn dan CTRL-AAV-scr. (F) Model ki'n ganny propoze i montre lefe proteksyon upregulation PCx neronal.
an gro, lenformasyon ki nou donnen isi i montre ki re-ekspresyon MFN2 i kapab konpletman sov PN avanse avek defisians OXPHOS sever, deplesyon mtDNA sever, e morfolozi ista-like ekstrememan abnormal, e par sa i donn progre kontinyel menm dan bann maladi avanse. nerodezenerasyon i donn levidans reversib lo staz avan lanmor selil. Sa degre fleksibilite metabolik i ganny plis met lanfaz lo la par abilite bann neron pou ensit ateroskleroz (en rewiring dan sikl TCA), ki anpes lekspresyon PCx dan bann PN ki napa OXPHOS e i amelyor lanmor selil, e alor zwe en rol proteksyon (Figure 5F).
dan sa letid, nou'n donn levidans ki larepons PNs a disfonksyonnman OXPHOS se pou gradyelman konverz ver ateroskleroz sikl TCA atraver semen aktivasyon diferansyel aktive par bann progranm metabolik. nou'n konfirm analiz proteomik avek plizyer metod konplemanter e revele ki ler i ganny defye par en disfonksyonnman mitokondriyal sever, bann neron i annan en form elastisite metabolik ki pa ti'n ganny konnen oparavan. Pour nou sirpriz, prosesis rewiring antye pa neseserman mark leta metabolik terminal ki akonpanny nerodezenerasyon gradyelman e ireversibman, me nou lenformasyon i sizere ki i kapab konstitye en neron mentenans menm dan staz avan lanmor selil Mekanizm konpansasyon fonksyonnel. sa konsta i endike ki bann neron i annan en degre konsiderab plastisite metabolik dan lekor. Sa fe i prouve ki re-lentrodiksyon pli tar MFN2 i kapab ranvers lekspresyon bann marker metabolik kle e anpes dezenerasyon PN. o kontrer, i anpes ateroskleroz e akseler bann nerf. transseksyel.
Enn bann konklizyon pli enteresan dan nou resers se ki bann PN ki napa OXPHOS i kapab modifye metabolism sikl TCA par up-regulate bann lanzim ki spesifikman stimil arterioskleroz. rearanzman metabolik i en karakteristik komen bann selil kanser, serten ki depan lo glutamine pou konplemant bann entermedyer sikl TCA pou prodwi bann ekivalan rediksyon, ki diriz lasenn respiratwar e mentenir prodiksyon bann prekurser biosintez lipid ek nikleotid (39 , 40). En letid resan in montre ki dan bann tisi periferik ki pe eksperyans disfonksyonnman OXPHOS, rekoneksyon metabolism glutamine/glutamate i osi en karakteristik prominen (5, 41), kot direksyon larantre glutamine dan sikl TCA i depan lo Akoz severite blesir OXPHOS (41). ). Sepandan, i annan en mankman levidans kler lo okenn similarite plastisite metabolik neronal dan lekor e son relevans posib dan konteks sa maladi. dan en letid in vitro resan, bann neron kortikal primer ti ganny demontre pou mobiliz bann basen glutamate pou nerotransmisyon, e par sa promot metabolism oksidatif ek ateroskleroz anba bann kondisyon stres metabolik (42). I bon note ki anba lenibisyon farmakolozik lanzim sikl TCA succinate dehydrogenase, carboxylation pyruvate i ganny kwar pou mentenir sentes oxaloacetate dan bann neron granul serebel kiltive (34). Sepandan, relevans fizyolozik sa bann mekanizm avek tisi laservel (kot ateroskleroz i ganny kwar i prensipalman limite avek bann astrosit) i ankor annan en sinifikasyon fizyolozik enportan (43). dan sa ka, nou lenformasyon i montre ki bann PN andomaze par OXPHOS dan lekor i kapab ganny sanze pour degradasyon BCAA e karboksilasyon pyruvate, ki de sours prensipal siplemantasyon bann entermedyer pool TCA. Malgre ki kontribisyon potatif katabolism BCAA dan metabolism lenerzi neronal in ganny propoze, an plis ki rol glutamate ek GABA pou nerotransmisyon (44), i ankor napa levidans pou sa bann mekanizm in vivo. Alor, i fasil pou spekile ki bann PN ki pa fonksyonnel i kapab otomatikman konpans konsomasyon bann entermedyer TCA ki ganny dirize par prosesis asimilasyon par ogmantasyon ateroskleroz. An partikilye, upregulation PCx i kapab neseser pou mentenir en demann ogmante pou aspartic acid, ki ganny sizere dan bann selil proliferasyon avek disfonksyonnman mitokondriyal (45). Sepandan, nou analiz metabolomik pa'n revel okenn sanzman enportan dan nivo stab lasid aspartik dan Mfn2cKO PNs (Figure S6A), ki prezimen i reflekte diferan litilizasyon metabolik asid aspartik ant bann selil ki pe prolifere ek bann neron post-mitotik. Menm si mekanizm egzakt PCx upregulation dan bann neron disfonksyonnel in vivo i reste pou ganny karakterize, nou'n demontre ki sa larepons prematire i zwe en rol enportan dan mentenans leta redox bann neron, ki ti ganny demontre dan bann eksperimantasyon FLIM lo bann tranch serebeler. An partikilye, anpes PNs up-regulate PCx i kapab anmenn en leta pli okside e akseler lanmor selil. aktivasyon degradasyon BCAA e karboksilasyon pyruvate pa bann fason pou karakteriz bann tisi periferik disfonksyonnman mitokondriyal (7). Alor, zot paret en karakteristik priyoriter bann neron ki napa OXPHOS, menm si pa sel karakteristik, ki enportan pou nerodezenerasyon. .
maladi serebeler i en kalite maladi nerodezenerativ eterozenn ki normalman manifeste koman ataksi e souvan andomaz PN (46). Sa popilasyon neron i partikilyerman vilnerab avek disfonksyonnman mitokondriyal akoz zot dezenerasyon selektif dan bann sourit i sifizan pou reprodwir bokou bann sentonm moter ki karakteriz ataksi spinocerebellar imen (16, 47, 48). dapre bann rapor, en model sourit transzenik avek en zenn mitan i asosye avek ataksi spinoserebeller imen e i annan disfonksyonnman mitokondriyal (49, 50), ki met lanfaz lo lenportans etidye konsekans defisians OXPHOS dan PNPH. Alor, i partikilyerman apropriye pou efektivman izol e etidye sa popilasyon neron inik. Sepandan, vi ki PN i tre sansib a presyon e i reprezant en proporsyon ba popilasyon selil serebel an antye, pour bokou letid baze lo omics, separasyon selektif zot koman bann selil antye i ankor en laspe difisil. Menm si i preski enposib pou akonplir en mank absoli kontaminasyon lezot kalite selil (sirtou bann tisi adilt), nou'n konbin en letap disosyasyon efektiv avek FACS pou obtenir en nonm sifizan bann neron vyab pou analiz proteomik anba, e annan en kouvertir protein ase o (apepre 3000 protein) konpare avek sa set lenformasyon egzistan dan set serebel (515). Par prezerv viabilite bann selil antye, metod ki nou donnen isi i permet nou non selman tyek bann sanzman dan bann semen metabolik dan mitokondri, me osi tyek bann sanzman dan son bann omolog sitoplazmik, ki konplemant litilizasyon bann tag manbràn mitokondriyal pou anrisir kalite selil Nouvo metod pou lakantite mitokondri dan bann tisi konpleks (255, 25). sa metod ki nou dekrir i pa zis relye avek letid bann selil Purkinje, me i kapab fasilman ganny aplike lo nenport kalite selil pou adres bann sanzman metabolik dan bann laservel malad, enkli lezot model disfonksyonnman mitokondriyal.
Finalman, nou'n idantifye en lafnet terapeutik pandan sa prosesis rearanzman metabolik ki kapab konpletman ranvers bann siny kle stres seliler e anpes dezenerasyon neronal. Alor, konpran bann lenplikasyon fonksyonnel sa rewiring ki'n ganny dekrir isi i kapab donn bann apersi fondamantal lo bann tretman posib pou mentenir viabilite neron pandan disfonksyonnman mitokondriyal. resers a lavenir ki annan pour bi analiz bann sanzman dan metabolism lenerzi dan lezot kalite selil laservel i neseser pour revel konpletman aplikabilite sa prensip pour lezot maladi neolozik.
bann sourit MitoPark in ganny dekrir oparavan (31). bann sourit C57BL/6N avek bann zenn loxP ki flank Mfn2 in ganny dekrir oparavan (18) e krwaze avek bann sourit L7-Cre (23). bann desandans doub eterozigot ki ti rezilta ti apre ganny krwaze avek bann sourit omozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP pou zener bann knockout zenn spesifik Purkinje pou Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). dan en sou-group akoupman, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ti ganny entrodwir atraver bann krwaze adisyonnel (20). Tou bann prosedir zannimo ti ganny fer an akor avek bann gidans Eropeen, nasyonal e enstitisyonnel e aprouve par LandesamtfürNatur sorti Umwelt e Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Lalmanny. travay lo zannimo i osi swiv gidans federasyon eropeen bann lasosyasyon lasyans zannimo laboratwar.
apre ki in anestezi dislokasyon serviks sa madanm ansent, anbriyon sourit i ganny izole (E13). Korteks ti ganny disekte dan solisyon disel balanse Hanks (HBSS) konplemante avek 10 mM Hepes e pase lo Dulbecco's Modified Eagle's Medium ki ti annan papain (20 U/ml) ek cysteine ​​(1μg/ml). Enkub tisi dan DMEM) e disosye li par dizesyon enzimatik. Ml) a 37°C pou 20 minit, e apre moulen mekanikman dan DMEM konplemante avek 10% serom bef fetal. bann selil ti ganny senmen lo bann kouvertir an ver kouver avek polylysine a en dansite 2×106 par 6 cm pla kiltir oubyen a en dansite 0.5×105 selil/cm2 pou analiz zimaz. Apre 4 erdtan, medyom ti ganny ranplase avek medyom san serom Neurobasal ki ti annan 1% sipleman B27 ek 0.5 mM GlutaMax. bann neron ti apre ganny mentenir a 37°C e 5% CO2 pandan sa eksperiman, e nouri en fwa par semenn. Pour kapab ensit rekombinasyon in vitro, 3μl (24-well culture dish) oubyen 0.5μl (24-well plate) sa vekter viris AAV9 swivan ti ganny servi pour tret bann neron lo dezyenm zour in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nimero katalog 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nimero katalog 105545-AAV9).
DNA konplemanter Mfn1 ek Mfn2 sourit (ki ganny obtenir avek plasmid Addgene #23212 ek #23213, respektivman) i ganny marke avek sekans V5 (GKPIPNPLLGLDST) kot C-terminus, e i ganny fizyonn avek mCherry dan kad atraver sekans T2A. Grx1-roGFP2 i en kado sorti kot Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). par ranplas kaset tdTomato an servan bann metod klonaz konvansyonnel, kaset ti ganny sou-klone dan backbone pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (limero referans Addgene 28306) pou prodwir pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ek pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 bann vekter. En stratezi parey ti ganny servi pou zener vekter kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pour kapab zener sa konstriksyon AAV-shPCx, en plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) i neseser, ki konteni sa sekans DNA ki ankod shRNA ki target PCx sourit (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGACTTAGA 3′) Anba kontrol promoter U6, mCherry i ganny servi anba kontrol promoter CMV. prodiksyon bann vekter AAV oksilyer ti ganny fer dapre lenstriksyon fabrikan (Cell Biolabs). an bref, servi en plasmid transfer ki anmenn mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Transfeksyon bann selil 29A-MFN2-V5) mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oubyen Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ki kod zenn, osi byen ki kod protein kapsid AAV1 e plasmid plasmid anbalaz protein akseswar, an servan metod fosfat kalsiom. sa sipernatan viris brit ti ganny obtenir par bann sikl freeze-thaw dan en ben ice/etanol sek e bann selil lysed dan phosphate buffered saline (PBS). Vekter AAV ti ganny pirifye par ultrasantrifigasyon gradient iodixanol diskontini (24 erdtan a 32,000 rpm e 4°C) e konsantre an servan en filter santrifiz Amicon ultra-15. Tit zenom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopi zenom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ti ganny dekrir oparavan (45), kantitatif par PCR (PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ek AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
bann neron primer ti ganny grate dan ice-cold 1x PBS, pellet, e apre omozenize dan 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer ki annan fosfataz ek inhibiter proteaz (Roche). Kantifikasyon protein ti ganny fer an servan tes bicinchoninic acid (Thermo Fisher Scientific). bann protein ti apre ganny separe par SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, e apre ganny blotte lo en manbràn polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). blok bann sit non-spesifik e enkile avek antikor primer (vwar latab S1 pou detay) dan 5% dile dan TBST (Tris-buffered saline avek Tween), bann letap lav ek antikor segonder dan TBST Enkubate. enkile avek antikor primer pandan lannwit a +4°C. apre lave, aplik antikor segonder pou 2 erdtan a tanperatir lasanm. apre, par enkubasyon menm blot avek en antikor anti-β-actin, menm loading ti ganny konfirmen. deteksyon par konversyon an chemiluminescence e amelyor chemiluminecence (GE Healthcare).
bann neron ki ti'n ganny senmen oparavan lo bann kouvertir an ver ti ganny fikse avek 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS a sa pwen letan spesifye a tanperatir lasanm pou 10 minit. bann kouvertir i premyerman ganny perme avek 0.1% Triton X-100/PBS pour 5 minit a tanperatir lasanm, e apre dan en tampon blokaz [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. lo dezyenm zour, bann kouvertir ti ganny lave avek en tampon blokaz e enkile avek antikor segonder konzige avek fluorofor apropriye pou 2 erdtan a tanperatir lasanm; finalman, bann lesantiyon ti ganny lave byen dan PBS avek 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) i ganny kont-tenn e apre fikse lo sa glisad mikroskop avek Aqua-Poly/Mount.
bann sourit (mal ek fanm) ti ganny anestezi par linjeksyon intraperitoneal ketamine (130 mg/kg) ek xylazine (10 mg/kg) e administre par anba lapo avek analzesik carprofen (5 mg/kg), e mete dan en lenstriman stereotaktik (Kopf) ekipe avek en warm. ekspoz krann e servi en dril danter pou mens sa parti korteks serebel ki koresponn avek lezo mis (depi lambda: lake 1.8, lateral 1, korespondan avek lobil IV ek V). servi en zegwiy sereng kourbe pou kree en pti trou dan krann avek swen pou evite deranz vaskilatir anba. Apre sa kapiler an ver mens i ganny dousman mete dan sa mikro-trou (depi -1.3 ziska -1 lo kote vantral dura mater), e 200 a 300 nl AAV i ganny enzekte dan sa mikro-enzekter (Narishige) avek bann sereng mannyel (Narishige) plizyer fwa a en presyon ba pandan en peryod letan ziska 20 minit. apre lenfizyon, plas sa kapiler pou ankor 10 minit pou les viris propaze konpletman. apre ki bann kapiler in ganny retire, lapo i ganny koud avek swen pou minimiz lenflamasyon blesir e les zannimo rekipere. bann zannimo ti ganny trete avek bann analzesik (caspofen) pour plizyer zour apre loperasyon, pandan ki zot kondisyon fizik ti ganny monitor avek swen e apre zot ti ganny etanize a sa moman ki ti'n ganny endike. Tou bann prosedir ti ganny fer an akor avek bann gidans Eropeen, nasyonal e enstitisyonnel e ti ganny aprouve par LandesamtfürNatur sorti Umwelt e Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Lalmanny.
bann zannimo ti ganny anestezi avek ketamine (100 mg/kg) ek xylazine (10 mg/kg), e leker ti ganny perfize avek 0.1 M PBS avan, e apre avek 4% PFA dan PBS. sa tisi ti ganny disekte e fikse dan 4% PFA/PBS pandan lannwit a 4°C. En kouto vibre (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ti ganny servi pou prepar bann seksyon sagittal (50 μm epe) sorti dan laservel fiks dan PBS. amwen ki i ganny spesifye otreman, kolorasyon bann seksyon ki pe flote libreman ti ganny fer parey in ganny dekrir pli o (13) a tanperatir lasanm e melanze. an bref, premyerman, bann tranch ki ti ganny obtenir ti ganny permeabilize avek 0.5% Triton X-100/PBS pou 15 minit a tanperatir lasanm; pour serten epitop (Pcx ek Shmt2), par dan en tampon tris-EDTA a 80°C (PH 9) sof bann morso pour 25 minit olye sa letap. apre, bann seksyon ti ganny enkile avek antikor primer (vwar latab S1) dan en tampon blokaz (3% BSA/PBS) a 4°C pandan lannwit avek melanz. son lannmen, bann seksyon ti ganny lave avek en tampon blokaz e enkile avek antikor segonder konzige avek fluorofor apropriye pou 2 erdtan a tanperatir lasanm; finalman, bann seksyon ti ganny lave byen dan PBS, kont-kolore avek DAPI, e apre fikse avek AquaPolymount lo en glisad mikroskop.
En mikroskop konfokal skann laser (TCS SP8-X oubyen TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ekipe avek en laser lalimyer blan e en laser ultraviolet 405 diode ti ganny servi pou zimaz sa lesantiyon. par eksitan fluorofor e kolekte sinyal avek Hybrid Detector (HyDs), lozisyel LAS-X ti ganny servi pou kolekte bann zimaz anpile an konformite avek lesantiyonnman Nyquist dan mod sekansyel: pou bann pano non-kantitatif, i bann sinyal tre dinamik (par egzanp, dan bann selil somatik ek dendrit) mtY FPD pou al lo nonm Hybrid PN mod). gating depi 0.3 ziska 6 ns i ganny aplike pou redwir background.
Zimaz an tan reel bann selil ki'n ganny triye. Apre triyaz dan medyom Neurobasal-A ki ti annan 1% sipleman B27 e 0.5 mM GlutaMax, bann selil ti ganny senmen imedyatman lo bann glisad an ver kouver avek poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, nimero katalog 80826) , e apre gard li a 37°C e 5% CO pour enn erdtan ziska selil rezourd. Zimaz an tan reel ti ganny fer lo en mikroskop konfokal skann laser Leica SP8 ekipe avek en laser blan, HyD, 63×[1.4 louvertir nimerik (NA)] lens obzektif delwil e en staz sofaz.
sa sourit ti ganny anestezi vitman avek dioksid karbonn e dekapite, laservel ti ganny retire vitman lo son krann, e koupe an seksyon 200μm epe (pou eksperimantasyon 13C) oubyen 275μm epe (pou de eksperimantasyon foton) ranpli avek sa bann materyo swivan. Walldorf, Lalmanny) i ranpli avek sa bann sibstans swivan: 125 mM ice-cold, carbon-saturated (95% O2 ek 5% CO2) low Ca2 + artificial cerebrospinal fluid (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodyum phosphate buffer, 2.5 mM gluse, 0.5 mM CaCl2 ek 3.5 mM MgCl2 (presyon osmotik 310 a 330 mmol). transfer bann morso laservel ki'n ganny obtenir dan en lasanm pre-enkubasyon ki annan plis Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodyum phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Cl. MgCl2) Mwayenn) pH 7.4 e 310 a 320 mmol).
pandan prosesis zimaz, bann morso ti ganny bouze dan en lasal zimaz dedye, e sa eksperiman ti ganny fer anba perfizyon ACSF kontinyel a en tanperatir konstan 32° a 33°C. En mikroskop skann laser miltifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ekipe avek en lens obzektif Leica 25x (NA 0.95, delo), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) ti ganny servi pou zimaz par morso. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM of Grx1-roGFP2. bann sanzman dan leta redox sitoplazmik bann PN ti ganny mezire par de-foton FLIM dan bann tranch laservel sagital, kot biosanser Grx1-roGFP2 ti target bann PN. dan kous PN, domenn akizisyon i ganny selekte apepre 50 a 80 μm anba sirfas tranch pou asire ki i annan en PN vyab (setadir, mank striktir perle oubyen sanzman morfolozik neronal tou dilon bann dendrit) e sanser roGFP2 doub pozitiv e AAV ki ankod shRNA PCx oubyen son sekans kontrol (sakenn lekspresyon mChery). kolekte bann zimaz avek 2x zoom nimerik [longer vag eksitasyon: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksyon: HyD entern, group filter fluorescein isothiocyanate (FITC)] e mwayenn zimaz dan 2 a 3 minit i ganny servi pou asire ki ase foton i ganny kolekte (1000 foton an tou) pou fitting kourb. sansibilite sa sond Grx1-roGFP2 e verifikasyon bann kondisyon FLIM ti ganny fer par sirvey valer lavi roGFP2 ler ti azout 10 mM H2O2 egzozenn avek perfizyon ACSF (pou maksimiz oksidasyon, ki an rezilta lavi ogmante), e apre azout 2 mM dithiothreit (diminyen degre rediksyon, an rezilta rediksyon diminisyon dan lavi) (Figure S8, D to G). servi lozisyel FLIMfit 5.1.1 pou analiz bann rezilta ki'n gannyen, fit sa kourb dekonpozisyon eksponansyel tousel lo sa zimaz antye avek IRF (fonksyon repons lenstriman) ki'n ganny mezire, e χ2 i apepre 1. pou kalkil lavi en sel PN, mask otour lekor nerf ti ganny desinen mannyelman, en lavi mwayenn dan sak mask ti ganny servi.
analiz potansyel mitokondriyal. Apre ki seksyon akit ti ganny enkile avek 100 nM TMRM direkteman azoute avek ACSF perfize pour 30 minit, bann sanzman potansyel mitokondriyal PNs ti ganny mezire par en mikroskop de-foton. zimaz TMRM ti ganny fer par eksit sond a 920 nm e servi HyD entern (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) pou kolekte bann sinyal; an servan menm longer vag eksitasyon me an servan en diferan HyD entern (FITC :525/50) pou zimaz mtYFP. servi ImageJ's Image Calculator plug-in pou evalye potansyel mitokondriyal o nivo en sel selil. an bref, ekwasyon plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) i ganny servi pou idantifye rezyon mitokondriyal ki montre sinyal TMRM dan Purkinje Somali dan zimaz konfokal single-stack sa kanal korespondan. Apre sa, rezyon piksel dan sa mask ki rezilta i ganny kantifye, e apre i ganny normalize lo zimaz korespondan threshold single-stack sa kanal mtYFP pou ganny sa fraksyon mitokondriyal ki montre potansyel mitokondriyal.
Sa zimaz ti ganny dekonvolye avek lozisyel Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pour bann portre scan bann tiles, montaz en sel tile i ganny fer an servan algoritm koud otomatik fourni par lozisyel LAS-X. Apre kalibrasyon zimaz, servi ImageJ ek Adobe Photoshop pou kontinyen proses zimaz e aziste laklerte ek kontras dan en fason iniform. servi Adobe Illustrator pou preparasyon grafik.
analiz focus mtDNA. lakantite lezyon mtDNA ti ganny kantifye lo bann seksyon serebeler ki ti ganny marke avek antikor kont DNA par mikroskop konfokal. sak rezyon target ti ganny kree pour lekor selil e nwayo sak selil, e rezyon respektiv ti ganny kalkile an servan Multi Measure plug-in (ImageJ software). tir rezyon nikleer avek rezyon lekor selil pou ganny rezyon sitoplazmik. Finalman, plug-in Analyze Particles (ImageJ software) ti ganny servi pou otomatikman kantifye bann pwen DNA sitoplazmik ki endike mtDNA lo zimaz threshold, e bann rezilta ki ti ganny obtenir ti ganny normalize avek mwayenn PN bann sourit CTRL. bann rezilta i ganny eksprimen koman lakantite mwayenn nikleozid par selil.
analiz lekspresyon protein. servi ImageJ's Image Calculator plug-in pou evalye lekspresyon protein dan PN o nivo selil tousel. an bref, dan zimaz konfokal en sel kous sa kanal korespondan, atraver ekwasyon: sinyal = min (mtYFP, antikor), rezyon mitokondriyal ki montre iminoreaktivite anver en serten antikor dan Purkina i ganny idantifye. Apre sa, rezyon piksel dan sa mask ki rezilta i ganny kantifye, e apre normalize lo zimaz korespondan threshold single-stack sa kanal mtYFP pou ganny sa fraksyon mitokondriyal sa protein ki ganny demontre.
analiz dansite selil Purkinje. Plug-in Cell Counter ImageJ ti ganny servi pou evalye dansite Purkinje par diviz lakantite selil Purkinje ki ti ganny konte par longer bag serebeler ki bann selil ki ti ganny konte i okipe.
preparasyon ek koleksyon lesantiyon. bann laservel sorti dan group kontrol ek bann sourit Mfn2cKO ti ganny fikse dan 2% PFA/2.5% glutaraldehyde dan 0.1 M phosphate buffer (PB), e apre bann seksyon koronal ti ganny prepare an servan bann ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Epeser 50 a 60 μm) Sa fix dan 1% PB buffer dan PB tetraoxide ek 1.5% potassium ferrocyanide a tanperatir lasanm pou 1 erdtan. bann seksyon ti ganny lave trwa fwa avek delo distile, e apre kolore avek 70% etanol ki ti annan 1% uranyl acetate pour 20 minit. bann seksyon ti apre ganny dezidrate dan lalkol gradye e enkli dan Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, nimero katalog 14040) ant bann glisad ver kouver avek silikon, e finalman a 60°C Polymerize dan four pou 48 erdtan. rezyon korteks serebeler ti ganny swazir e bann seksyon 50 nm ultrathin ti ganny koupe lo Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e swazir lo en grid fente kwiv 2×1 mm kouver avek film polystyrene. bann seksyon ti ganny kolore avek en solisyon 4% uranyl acetate dan H2O pour 10 minit, lave avek H2O plizyer fwa, apre avek Reynolds lead citrate dan H2O pour 10 minit, e apre lave avek H2O plizyer fwa. bann mikrograf ti ganny tire avek en mikroskop elektron transmisyon Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) an servan en kamera nimerik TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Lalmanny).
Pour bann sourit enfekte avek AAV, laservel ti ganny separe e koupe dan en seksyon sazital 1 milimet lepeser, e serebel ti ganny egzaminen an servan en mikroskop fluoresans pour idantifye bag enfekte avek AAV (setadir, mCherry ki pe eksprimen). zis bann eksperimantasyon kot linjeksyon AAV i anmenn en lefikasite transdiksyon tre o dan kous selil Purkinje (setadir preski kous antye) dan omwen de bag serebel konsekitiv ki ganny servi. sa boukl transdwir par AAV ti ganny mikrodisekte pou post-fiksasyon pandan lannwit (4% PFA ek 2.5% glutaraldeid dan 0.1 M tampon koko) e ganny prosese pli lwen. Pour EPON embedding, tisi fiks ti ganny lave avek 0.1 M sodyum cocoate buffer (Applichem), e enkile avek 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) dan 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) 4 erdtan, apre lave pour 2 erdtan. repet 3 fwa avek 0.1 M tampon cocamide. apre, sa seri etanol ki ti pe monte ti ganny servi pou enkile sak solisyon etanol a 4°C pou 15 minit pou dezidrat tisi. sa tisi ti ganny transfer dan propylene oxide e enkile pandan lannwit dan EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. met sa tisi dan EPON fre a tanperatir lasanm pou 2 erdtan, e apre met li a 62°C pou 72 erdtan. servi en ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) ek en kouto dyanman (Diatome, Biel, Switzerland) pou koup bann seksyon 70 nm ultrathin, e tenny avek 1.5% uranyl acetate pou 15 minit a 37°C, e tenny avek solisyon lead citrate 4 minit. bann mikrograf elektronik ti ganny tire an servan en mikroskop elektronik transmisyon JEM-2100 Plus (JEOL) ekipe avek Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) e lozisyel DigitalMicrograph (Gatan). pou analiz, bann mikrograf elektronik ti ganny fer avek 5000× ou 10,000× zoom dizital.
analiz morfolozik bann mitokondri. Pour tou bann analiz, bann kontour bann mitokondri endividyel ti ganny dekri mannyelman dan bann zimaz nimerik an servan lozisyel ImageJ. bann diferan paramet morfolozik i ganny analize. Dansite mitokondriyal i ganny eksprimen koman en poursantaz ki ganny obtenir par diviz total siperfisi mitokondriyal sak selil par siperfisi sitoplasm (siperfisi sitoplasm = siperfisi selil-siperfisi nwayo selil) × 100. Rond mitokondri i ganny kalkile avek formil [4π∙(siperfisi/perimet 2)]. morfolozi ista bann mitokondri ti ganny analize e divize an de kategori ("tubular" e "blister") dapre zot laform prensipal.
analiz lakantite ek dansite otofagozom/lizozom. servi lozisyel ImageJ pou mannyelman fer resorti bann kontour sak autophagosome/lysosome dan sa zimaz nimerik. Siperfisi otofagozom/lizozom i ganny eksprimen koman en poursantaz kalkile par diviz siperfisi total otofagozom/lizozom sak selil par siperfisi sitoplasm (siperfisi sitoplasm=siperfisi selil-siperfisi nwayo)×100. Dansite bann otofagozom/lizozom i ganny kalkile par diviz lakantite total par lakantite striktir otofagozom/lizozom par selil (an term siperfisi sitoplasmik) (siperfisi sitoplasmik = siperfisi selil-siperfisi nikleer).
Labeling pou seksyonnman akit e preparasyon lesantiyon. Pour bann eksperimantasyon ki demann labeling glikoz, transfer bann morso laservel akit dan en lasanm pre-enkubasyon, ki kontenir karbonn satire (95% O2 ek 5% CO2), o Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodyum phosphate buffer, 2.5 mM NaCl, 205 mM. d-glikoz, 1.0 mM CaCl 2 e 2.0 mM MgCl 2, aziste a pH 7.4 e 310 a 320 mOsm), dan ki glikoz i 13 C 6- sibstisyon glikoz (Eurisotop, nimero katalog CLM-1396). Pour bann eksperimantasyon ki demann labeling pyruvate, transfer bann morso laservel akit dan en pli o Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Cml e 20 MM. MgCl2, aziste avek pH 7.4 e 310 a 320mOsm), e azout 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nimero katalog CLM-1082). enkuba bann seksyon pou 90 minit a 37°C. a lafen sa eksperiman, bann seksyon ti ganny lave vitman avek en solisyon akeuz (pH 7.4) ki ti annan 75 mM karbonat ammonium, e apre omozenize dan 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: delo. Apre ki bann seksyon ti ganny enkile lo ice pour 30 minit, bann lesantiyon ti ganny santrifize a 21,000 g pour 10 minit a 4°C, e sa sipernatan kler ti ganny sek dan en konsantrater SpeedVac. sa pelet metabolit sek ki ti gannyen ti ganny stoke a -80°C ziska analiz.
analiz kromatografi likid-spektrometri mas 13 asid amine marke avek C. Pour analiz kromatografi likid-spektrometri mas (LC-MS), pelet metabolit ti ganny resuspend dan 75μl delo grad LC-MS (Honeywell). Apre santrifigasyon a 21,000 g pour 5 minit a 4°C, 20 μl sa sipernatan klarifye ti ganny servi pour analiz flux asid amine, tandis ki larestan ekstrak ti ganny servi imedyatman pour analiz anyon (vwar anba). analiz asid amine ti ganny fer an servan protokol derivatizasyon benzoyl chloride ki ti ganny dekrir oparavan (55, 56). dan premye letap, 10μl 100 mM sodyum carbonate (Sigma-Aldrich) ti ganny azoute avek 20μl ekstrak metabolit, e apre 10μl 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ti ganny azoute avek ACN grad LC. sa lesantiyon ti ganny vortex en pti moman e apre santrifize a 21,000 g pou 5 minit a 20°C. transfer sa sipernatan ki'n ganny netwaye dan en flakon 2 ml autosampler avek en insert an ver konik (200 μl volim). bann lesantiyon ti ganny analize an servan sistenm LC ultra-o performans Acquity iClass (Waters) konekte avek Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) spektromet mas presizyon o rezolisyon (Thermo Fisher Scientific). Pour analiz, 2μl sa lesantiyon derivatize ti ganny enzekte dan en kolonn T3 silica 100×1.0 mm o lafors (Waters) ki ti annan 1.8μm partikil. to koule i 100μl/min, e sistenm tampon i konpoze avek tampon A (10 mM formate ammonium ek 0.15% asid formik dan delo) ek tampon B (ACN). gradyan i konm swivan: 0%B a 0 minit; 0%B. 0 a 15% B a 0 a 0.1 minit; 15 a 17% B a 0.1 a 0.5 minit; B a 17 a 55% a 0.5 a 14 minit; B a 55 a 70% a 14 a 14.5 minit; a 14.5 a 70 a 100% B a 18 minit; 100% B a 18 a 19 minit; 100 a 0% B a 19 a 19.1 minit; 0% B a 19.1 a 28 minit (55, 56). Spektrometr mas QE-HF i fonksyonn dan mod ionizasyon pozitiv avek en ranze mas m/z (rapor mas/sarz) 50 a 750. Rezolisyon aplike i 60,000, e target ion kontrol gain (AGC) ki ganny obtenir i 3×106, e letan ion maksimonm i 10 mil segonn. sours ionizasyon electrospray (ESI) i fonksyonn a en voltaz spray 3.5 kV, en tanperatir kapiler 250°C, en sirkilasyon ler 60 AU (younit arbitrer), e en sirkilasyon ler oksilyer 20 AU. 250°C. lens S i ganny mete lo 60 AU.
Analiz kromatografi anion-MS bann lasid organik marke 13C. Larestan presipitasyon metabolit (55μl) ti ganny analize an servan en sistenm kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) konekte avek en spektromet mas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). an bref, 5μl ekstrak metabolit ti ganny enzekte dan en kolonn Dionex IonPac AS11-HC ekipe avek HPLC (2 mm×250 mm, groser partikil 4μm, Thermo Fisher Scientific) dan mod push-in partial loop avek en rapor ranpli 1. ) kolonn Dionex IonPac AG11-HC mmgard (250 mm, x250 mm 4μm, Thermo Fisher Scientific). tanperatir kolonn i ganny mentenir a 30°C, e autosampler i ganny mete a 6°C. servi en kartridz idroksid potasyom ki annan delo deionize pou prodwir en gradient idroksid potasyom atraver zenerater elyan. Separasyon bann metabolit a en debi 380μl/min, an aplikan sa gradient swivan: 0 a 3 minit, 10 mM KOH; 3 a 12 minit, 10 a 50 mM KOH; 12 a 19 minit, 50 a 100 mM KOH; 19 a 21 minit, 100 mM KOH; 21 a 21.5 minit, 100 a 10 mM KOH. sa kolonn ti ganny re-ekilibre anba 10 mM KOH pou 8.5 minit.
bann metabolit ki'n ganny elye i ganny konbine avek en kouran sipleman isopropanol 150μl/min apre sa kolonn e apre i ganny dirize ver en spektromet mas o rezolisyon ki pe fonksyonn dan mod ionizasyon negativ. MS pe monitor ranze mas depi m/z 50 ziska 750 avek en rezolisyon 60,000. AGC i ganny mete a 1×106, e letan maksimonm ion i ganny garde a 100 ms. sours ESI sofe ti ganny fonksyonnen a en voltaz spray 3.5 kV. bann lezot seting sours ion i konm swivan: tanperatir kapiler 275°C; koule gaz dan latwal, 60 AU; koule gaz oksilyer, 20 AU a 300°C, e S lens setting a 60 AU.
analiz lenformasyon lo bann metabolit marke 13C. servi lozisyel TraceFinder (versyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) pou analiz lenformasyon lo rapor izotop. lidantite sak konpoze ti ganny verifye par en konpoze referans serye e analize endepandaman. Pour kapab fer analiz lanrisisman izotop, rezyon kromatogram ion ki'n ganny tire (XIC) sak izotop 13C (Mn) ti ganny tire dan [M + H] +, kot n i nimero karbonn sa konpoze target, ki ganny servi pour analiz bann asid amine oubyen [ MH] + i ganny servi pour analiz bann anyon. presizyon mas XIC i mwens ki senk parti par milyon, e presizyon RT i 0.05 minit. analiz lanrisisman i ganny fer par kalkil rapor sak izotop detekte avek sonm tou izotop sa konpoze korespondan. Sa bann rapor i ganny donnen koman bann valer poursantaz pour sak izotop, e bann rezilta i ganny eksprimen koman lanrisisman poursantaz moler (MPE), parey in ganny dekrir oparavan (42).
sa pelet neron konzele ti ganny omozenize dan 80% metanol (v/v) fre parey ice, vortexed, e enkile a -20°C pou 30 minit. Vortex sa lesantiyon ankor e melanze a +4°C pou 30 minit. sa lesantiyon ti ganny santrifize a 21,000 g pou 5 minit a 4°C, e apre sa sipernatant ki ti rezilta ti ganny kolekte e sek an servan en konsantrater SpeedVac a 25°C pou bann analiz swivan. parey in ganny dekrir pli o, analiz LC-MS ti ganny fer lo bann asid amine bann selil triye. An servan TraceFinder (versyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), analiz lenformasyon ti ganny fer an servan mas monoisotopik sak konpoze. Normalizasyon kantite lenformasyon metabolit ti ganny fer an servan package lozisyel preprocessCore (57).
preparasyon morso. sa sourit ti ganny anestezi vitman avek dioksid karbonn e dekapite, laservel ti ganny retire vitman lo son krann, e sa kouto vibrasyon ranpli avek ice (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ti ganny servi pou koup li an seksyon 300 a 375 μm sagital gaz karbonn e COD (25% 25) Ca2 + ACSF ba (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodyum phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glikoz, 1.0 mM CaCl2 e 6.0 mM MgCl2 Aziste avek pH 44 e 300 mO). transfer bann morso laservel ki'n ganny obtenir dan en lasanm ki annan plis Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodyum phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM Ca 2 mM e pH 2 MM 7.4 e 310 a 320 mOsm). stor bann morso pou 20 a 30 minit pou ki zot kapab ganny repare avan rikord.
lanrezistreman. en staz mikroskop ekipe avek en lasanm lanrezistreman fiks e en lens obzektif imersyon dan delo 20x (Scientifica) ti ganny servi pou tou bann lanrezistreman. bann selil Purkinje potatif ti ganny idantifye par (i) groser lekor, (ii) lokasyon anatomik serebel, e (iii) lekspresyon zenn raporter mtYFP fluoresan. Pipet patch avek en rezistans bout 5 a 11 megohms i ganny tire par en kapiler an ver borosilikat (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) e en pipet orizontal Instruments (P-10000, Sutter, Notova, CA). Tou bann lanrezistreman ti ganny fer par ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), ki ti ganny kontrole par lozisyel Signal (versyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). sa eksperimantasyon ti ganny rikorde a en to lesantiyonnman 12.5 kHz. sinyal i ganny filtre avek de filter Bessel short-pass avek frekans koupe 1.3 e 10 kHz respektivman. Kapasite sa manbràn ek sa pipet i ganny konpanse par sa sirkwi konpansasyon an servan sa lanplifikater. Tou bann eksperimantasyon ti ganny fer anba kontrol en kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Lalmanny), ki ti ganny kontrole par lozisyel Hokawo (versyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Lalmanny).
konfigirasyon ek analiz routin bann selil antye. Imedyatman avan rikord, ranpli sa pipet avek sa solisyon entern ki annan sa bann sibstans swivan: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gliconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (MMg MM), 5 MM trifosiom. (GTP) (Na) ek 10.0 mM creatinine phosphate ti ganny aziste a pH 7.25, e presyon osmotik ti 290 mOsm (sucrose). Imedyatman apre ki in aplik en lafors 0 pA pou kas sa manbràn, potansyel manbràn repo ti ganny mezire. rezistans antre i ganny mezire par aplik bann kouran iperpolarize -40, -30, -20, e -10 pA. mezir magnitid larepons voltaz e servi lalwa Ohm pou kalkil rezistans antre. aktivite spontane ti ganny rikorde dan en klem voltaz pou 5 minit, e sPSC ti ganny idantifye e mezire dan Igor Pro (versyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) an servan en skript rekonesans semi-otomatik. kourb IV ek kouran stasyoner i ganny mezire par ser batri a diferan potansyel (apartir -110 mV) e ogmant voltaz par bann letap 5 mV. prodiksyon AP ti ganny teste par aplik en kouran depolarizasyon. tenir sa selil a -70 mV anmenmtan ki ou pe aplik en kouran depolarizan. aziste groser letap sak younit lanrezistreman separeman (10 a 60 pA). Kalkil frekans maksimonm AP par kont mannyelman bann pik batman leker ki koz frekans AP pli o. threshold AP i ganny analize an servan dezyenm derive sa puls depolarizasyon ki premyerman deklans enn ou plizyer AP.
konfigirasyon ek analiz bann landrwa perfore. fer lanrezistreman patch perfore an servan bann protokol standar. servi en pipet san ATP ek GTP ki napa sa bann zengredyen swivan: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ek 2 mM MgCl2, e aziste avek pH 7.2 (an servan KOH). ATP ek GTP i ganny omet dan solisyon enterselilyer pou anpes permeabilite enkontrole dan manbràn selil. Pipet patch i ranpli avek en solisyon entern ki annan amphotericin (apepre 200 a 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pou ganny en rikord patch perse. Amphotericin ti ganny fonn dan dimethyl sulfoxide (konsantrasyon final: 0.1 a 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). konsantrasyon DMSO ki ti ganny servi ti napa okenn lefe enportan lo bann neron ki ti ganny etidye. Pandan prosesis pers, rezistans kanal (Ra) ti kontinyelman ganny monitor, e eksperiman ti komanse apre ki lanplitid Ra ek AP ti stabilize (20-40 minit). aktivite spontane i ganny mezire dan en kranp voltaz e/oubyen kouran pou 2 a 5 minit. analiz lenformasyon ti ganny fer an servan Igor Pro (versyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) e GraphPad Prism (versyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Leta Zini). pou kapab idantifye bann AP spontane, plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro i ganny servi. idantifye bann AP otomatikman an servan en threshold donnen, ki ganny aziste endividyelman pour sak rikord. An servan lenterval spike, determin frekans spike avek frekans spike maksimonm enstantane e frekans spike mwayenn.
izolasyon PN. An adaptan avek protokol ki ti'n ganny pibliye oparavan, PNs ti ganny pirifye sorti dan serebelom sourit a en staz spesifik (58). an bref, serebel ti ganny disekte e koupe dan en medyom disosyasyon ice-cold [san HBSS Ca2+ ek Mg2+, konplemante avek 20 mM glikoz, penisilin (50 U/ml) ek streptomycin (0.05 mg/ ml)], e apre dizer sa medyom dan papain [HBSS, HC-1 · (1 mg / ml), papain (16 U / ml) ek deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Tret pou 30 minit a 30°C. premyerman lav bann tisi dan medyom HBSS ki annan lamok dizef (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ek DNase (0.1 mg/ml) a tanperatir lasanm pou anpes dizesyon anzimatik, e apre dan medyom HBSS ki annan 20 mM glikoz Dousman grind dan HBSS peillinic, peillin/ml/ml, strep (0.05 mg/ml) ek DNase (0.1 mg/ml) i larg bann selil tousel. sispansyon selil ki ti rezilta ti ganny filtre atraver en filtre selil 70μm, apre bann selil ti ganny pelete par santrifigasyon (1110 rpm, 5 minit, 4°C) e resuspend dan medyonm triyaz [HBSS, konplemante avek 20 mM glikoz, 20% fetal bovine ) Serom, pelinik (50) strepcylinic (50) (0.05 mg/ml)]; evalye viabilite selil avek propidium iodide e aziste dansite selil a 1×106 a 2×106 selil/ml. avan flow cytometry, sispansyon ti ganny filtre atraver en filtre selil 50 μm.
Flow cytometer. Triyaz selil ti ganny fer a 4°C an servan masin FACSAria III (BD Biosciences) ek lozisyel FACSDiva (BD Biosciences, versyon 8.0.1). sispansyon selil ti ganny klase an servan en noz 100 μm anba en presyon 20 psi a en to ~2800 levennman/segonn. Vi ki bann kriter gating tradisyonnel (granser selil, diskriminasyon bimodal, e karakteristik dispersyon) pa kapab asir izolasyon korek PN avek lezot kalite selil, stratezi gating i ganny mete baze lo konparezon direk lentansite YFP ek otofloresans dan mitoYFP+ ​​�e kontrol mitoYFP − Mice. YFP i ganny eksite par iradyasyon sa lesantiyon avek en laliny laser 488 nm, e sinyal i ganny detekte an servan en filter 530/30 nm band pass. dan bann sourit mitoYFP+, lafors relatif zenn raporter Rosa26-mitoYFP i osi ganny servi pou fer distenksyon ant lekor neron ek bann fragman axon. 7-AAD i ganny eksite avek en laser zonn 561 nm e detekte avek en filter bandpass 675/20 nm pou eksklir bann selil mor. Pour kapab separ bann astrosit anmenmtan, sispansyon selil ti ganny kolore avek ACSA-2-APC, apre sa lesantiyon ti ganny iradye avek en laliny laser 640 nm, e en filter bandpass 660/20 nm ti ganny servi pour detekte sinyal.
bann selil kolekte ti ganny pelete par santrifigasyon (1110 rpm, 5 minit, 4°C) e stoke a -80°C ziska ler i ganny servi. bann sourit Mfn2cKO ek zot bann pti lisyen i ganny klasifye menm zour pou minimiz varyabilite prosedir. Prezantasyon ek analiz lenformasyon FACS ti ganny fer an servan lozisyel FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
parey in ganny mansyonnen pli o (59), PCR an tan-reel i ganny servi pou izol DNA avek bann neron ki'n ganny triye pou kantite mtDNA ki swiv. linearite ek sansibilite threshold ti inisyalman ganny teste par fer qPCR lo diferan nonm selil. an bref, kolekte 300 PN dan en tampon liz ki konpoze avek 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 e proteinase K (200 ng/ml) e enkile a 55°C 120 minit. bann selil ti ganny enkile ankor a 95°C pou 10 minit pou asir inaktivasyon konplet proteinaz K. An servan en sond TaqMan (Thermo Fisher) spesifik a mt-Nd1, mtDNA ti ganny mezire par semi-kantitatif PCR dan sistenm 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Fiscients). Lasyans, nimero katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nimero katalog AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, nimero katalog Hs99999901_s1) bann zenn.
preparasyon lesantiyon proteom. par sof sa solisyon a 95°C pour 10 minit e sonikasyon, dan sa tampon liz [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide e 100 mM tris-lyse frozen newron pellets HC]. lo Bioruptor (Diagenode) pou 10 minit (30 segonn batman leker / 30 segonn peryod poz). sa lesantiyon ti ganny dilye 1:10 dan 20 mM tris-HCl (pH 8.0), melanze avek 300 ng trypsin gold (Promega), e enkile pandan lannwit a 37°C pou atenn en dizesyon konplet. lo dezyenm zour, sa lesantiyon ti ganny santrifize a 20,000 g pou 20 minit. sa sipernatan ti ganny dilye avek 0.1% lasid formik, e sa solisyon ti ganny desale avek StageTips ki ti'n ganny fer par zot menm. sa lesantiyon ti ganny sek dan en lenstriman SpeedVac (konsantrater Eppendorf plis 5305) a 45°C, e apre sa peptid ti ganny sispann dan 0.1% lasid formik. tou bann lesantiyon ti ganny prepare anmenmtan par menm dimoun. Pour kapab analiz bann lesantiyon astrosit, 4 μg peptid desal ti ganny marke avek en tandem mass tag (TMT10plex, nimero katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) avek en rapor peptid avek reaktan TMT 1:20. Pour labeling TMT, 0.8 mg reaktan TMT ti ganny resuspend dan 70 μl ACN anhydrous, e sa peptid sek ti ganny rekonstitye dan 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), avek ki 7 μl reaktan TMT dan ACN ti ganny azoute. konsantrasyon ti 43.75%. apre 60 minit enkubasyon, reaksyon ti ganny tennyen avek 2 μl 5% hydroxylamine. bann peptid ki'n ganny marke ti ganny kolekte, sek, resuspend dan 200μl 0.1% asid formik (FA), divize an de, e apre desalte an servan bann StageTips ki'n ganny fer par zot menm. An servan UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), enn sa de lanmwatye ti ganny fraksyonnen lo en kolonn kromatografik 1mm x 150mm Acquity ranpli avek partikil 130Å1.7μm C18 (Waters, katalog No SKU: 196366). Thermo Fisher Scientific). separ bann peptid a en debi 30μl/min, separ depi 1% ziska 50% tampon B pou 85 minit avek en gradient par letap 96 minit, depi 50% ziska 95% tampon B pou 3 minit, apre 8 minit pou 95% tampon B; tampon A i 5% ACN e 10 mM bikarbonat ammonium (ABC), e tampon B i 80% ACN e 10 mM ABC. kolekte bann fraksyon tou le 3 minit e konbin zot an de group (1 + 17, 2 + 18, eksetera) e fer zot sek dan en santrifiz vid.
analiz LC-MS/MS. Pour spektrometri mas, bann peptid (nimero r119.aq) ti ganny separe lo en kolonn analitikal PicoFrit 25 cm, 75 μm dyamet entern (nouvo lenz obzektif, nimero parti PF7508250) ekipe avek 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maischr, Maisch-AQ), E. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Lalmanny). sa kolonn ti ganny mentenir a 50°C. bann tampon A ek B i 0.1% lasid formik dan delo e 0.1% lasid formik dan 80% ACN, respektivman. bann peptid ti ganny separe sorti 6% a 31% tampon B pou 65 minit e sorti 31% a 50% tampon B pou 5 minit avek en gradient 200 nl/min. bann peptid ki'n ganny elye ti ganny analize lo en spektromet mas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). mezir m/z prekurser peptid i ganny fer avek en rezolisyon 120,000 dan ran 350 a 1500 m/z. An servan 27% lenerzi kolizyon normalize, prekurser pli for avek en leta sarz 2 a 6 i ganny swazir pou dekolte disosyasyon latrap C o lenerzi (HCD). letan sikl i ganny mete a 1 s. valer m/z sa fragman peptid ti ganny mezire dan latrap ion an servan pli pti target AGC 5×104 e letan enzeksyon maksimonm 86 ms. apre fragmantasyon, prekurser ti ganny mete lo lalis eksklizyon dinamik pou 45 s. bann peptid TMT-labeled ti ganny separe lo en kolonn 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, nimero katalog 164942), e bann spektra migrasyon ti ganny analize lo en spektromet mas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ekipe avek bann iveon simetrik o-field (IMS) lekipman (Thermo Fisher Scientific) i fonksyonn a de tansyon konpansasyon −50 e −70 V. MS3 selekte baze lo prekurser senkronizasyon i ganny servi pou mezir sinyal ion rapor TMT. separasyon peptid ti ganny fer lo EASY-nLC 1200, an servan en 90% elisyon gradient lineer, avek en konsantrasyon tampon 6% a 31%; tampon A ti 0.1% FA, e tampon B ti 0.1% FA e 80% ACN. sa kolonn analiz i ganny fonksyonnen a 50°C. servi FreeStyle (versyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) pou separ dosye orizinal dapre voltaz konpansasyon FAIMS.
idantifikasyon ek kantite protein. An servan moter resers entegre Andromeda, lenformasyon orizinal ti ganny analize an servan MaxQuant versyon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). An plis ki bann sekans Cre recombinase ek YFP ki ti ganny obtenir avek Aequorea victoria, bann spektr fragman peptid ti ganny rode pour sekans kanonik e sekans izoform referans proteom sourit (Proteome ID UP000000589, telesarze sorti kot UniProt an Me 2017). oksidasyon metyonin ek asetilasyon N-terminal protein ti ganny mete koman bann modifikasyon varyab; methylation cysteine ​​ficarbamoyl ti ganny mete koman bann modifikasyon fiks. bann paramet dizesyon i ganny mete lo “spesifisite” e “trypsin/P”. lakantite minimonm peptid ek peptid razwar ki ganny servi pou idantifikasyon protein i 1; lakantite minimonm bann peptid inik i 0. Anba bann kondisyon matching map peptid, to idantifikasyon protein ti 0.01. opsyon “dezyenm peptid” i aktive. servi opsyon “match between runs” pou transfer bann idantifikasyon avek sikse ant bann diferan dosye orizinal. servi LFQ minimum ratio count 1 pou kantite san label (LFQ) (60). lentansite LFQ i ganny filtre pour omwen de valer valid dan omwen en group zenotip a sak pwen letan, e i ganny ekstrapole sorti dan en distribisyon normal avek en larzer. 0.3 e desann 1.8. servi platform konpiter Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ek R (https://r-project.org/) pou analiz bann rezilta LFQ. En tes t modere de-fason sorti dan package lozisyel limma ti ganny servi pou analiz lekspresyon diferansyel (61). analiz data eksploratwar i ganny fer an servan ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. lenformasyon proteomik baze lo TMT ti ganny analize an servan MaxQuant versyon 1.6.10.43. Rod lenformasyon proteomik brit sorti dan database proteomik imen UniProt, ki ti ganny telesarze an Septanm 2018. Analiz i enkli fakter koreksyon pirte izotop fourni par fabrikan. servi limma dan R pou analiz lekspresyon diferansyel. Lenformasyon orizinal, rezilta resers dan database, e workflow ek rezilta analiz data i tou ganny stoke dan lalyans ProteomeXchange atraver repozitwar partener PRIDE avek idantifikasyon set lenformasyon PXD019690.
bann lanotasyon fonksyonnel i anrisir analiz. zouti Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ti ganny servi pou determin larises bann term anotasyon fonksyonnel sa data set a 8 semenn (Figure 1). an bref, lalis protein kantitatif ki'n ganny obtenir avek analiz lenformasyon LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) i ganny servi avek sa bann kriter filter swivan: Mus musculus i ganny selekte koman lespes ek fon, e sa kategori i montre valer P ki'n ganny aziste par Benjamini pour lanrisisman 0.05 ou pli ba i ganny konsidere koman enportan. Pour sa graf, sa senk kategori ekse dan sak group baze lo valer P aziste i ganny montre. An servan miltip t-test, an servan progranm boost lineer de staz Benjamini, Krieger, e Yekutieli (Q = 5%), analiz lekspresyon protein par letan i ganny fer lo bann kandida enportan idantifye dan sak kategori, e sak ranze i ganny analize separeman. napa nesesite pou adopte en SD konsistan.
Pour kapab konpar rezilta sa letid avek bann database pibliye e zener en dyagram Venn dan Fig 1, nou ti konbin lalis protein kantitatif avek bann lanotasyon MitoCarta 2.0 (24). servi zouti online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pou prodwir sa dyagram.
Pour lenformasyon detaye lo bann prosedir statistik ki ganny servi pour analiz proteomik, silvouple refer avek seksyon korespondan Materyo ek Metod. Pour tou lezot eksperiman, lenformasyon detaye i kapab ganny trouve dan lezann korespondan. amwen ki i ganny spesifye otreman, tou lenformasyon i ganny eksprimen koman mwayenn ± SEM, e tou bann analiz statistik ti ganny fer an servan lozisyel GraphPad Prism 8.1.2.
Pour bann materyo siplemanter pour sa lartik, silvouple vwar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Sa i en lartik akse ouver ki ganny distribye anba bann term Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ki permet litilizasyon, distribisyon e reprodiksyon dan nenport ki medyom, tan ki litilizasyon final pa pour benefis komersyal e premis se ki travay orizinal i korek. Referans.
Not: Nou zis demann ou pou donn ou ladres imel pou ki sa dimoun ki ou rekomande lo sa paz i konnen ki ou anvi zot vwar sa imel e ki i pa spam. nou pa pou kaptir okenn ladres imel.
sa kestyon i ganny servi pou teste si ou en viziter e anpes soumisyon spam otomatik.
par E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
analiz proteomik bann neron ki pa fonksyonnel in revele ki bann progranm metabolik i ganny aktive pou kontrer nerodezenerasyon.
par E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
analiz proteomik bann neron ki pa fonksyonnel in revele ki bann progranm metabolik i ganny aktive pou kontrer nerodezenerasyon.
©2020 Lasosyasyon Ameriken pou Lavansman Lasyans. tou drwa rezerve. AAAS i en partener HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ek COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.