Prezan†Ladres aktyel: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
sant reaksyon rekolt lalimyer konpleks 1 (RC-LH1) i konponan fotosintetik debaz bann bakteri fototrofik mov. nou ti entrodwir de striktir mikroskopi krio-elektron dan konpleks RC-LH1 sorti kot Rhodopseudomonas palustris. striktir rezolisyon 2.65-Å konpleks RC-LH114-W i konpoze de 14 sou-unit LH1 loop otour RC, ki ganny enteronpe par protein W, tandis ki konpleks san protein-W i konpletman konpozisyon RC antoure par RC. ferm 16 subunit LH1 loop. Konparezon sa bann striktir i donn en apersi lo dinamik quinone dan konpleks RC-LH1, enkli bann sanzman konformasyonnel ki pa ti'n ganny determinen oparavan ler pe atas quinone kot sit RC QB, osi byen ki lokasyon bann sit atasman quinone oksilyer, ki ede Pas zot avek RC. striktir inik protein W i anpes fermtir LH1 loop, e alor kree en kanal pou akseler lesanz quinone/quinolone.
lenerzi ki ganny donnen par fotosintez i kapab soutenir preski tou lavi lo later, e i annan en gran potansyel pou bioteknolozi soler. anmenmtan ki i promot fotosintez global, bann bakteri fototrofik mov i osi egzibit diferan mod lenerzi e kapasite metabolik. zot kapab evit fotosintez e grandi koman bann bakteri eterotrofik dan fernwanr, kapab aranz azot ek dioksid karbonn, prodwi idrozenn, e degrad bann konpoze aromatik (1-3). pou kapab donn lenerzi pou sa bann prosesis, lalimyer i bezwen ganny konverti vitman e efikasman an lenerzi simik. Sa prosesis i komanse ler sa konpleks lantenn ki trap lalimyer i abzorb lalimyer e transfer lenerzi ki’n ganny atrape dan sant reaksyon (RC), e alor komans separasyon sarz (4 – 7). Younit debaz fotosintez dan bann bakteri fototrofik mov i konpoze avek tip 2 RC, antoure par konpleks rekolt lalimyer 1 (LH1), ki form konpleks nwayo RC-LH1. LH1 i ganny formen par en lareye αβ heterodimers kourbe, sakenn ki atas de molekil klorofil bakteri (BChl) a e enn ou de karotenoid (8-12). lantenn LH1 pli senp i konpoze avek 16 ou 17 αβ heterodimers ki antour RC (9-13) dan en boukl fermen, me dan lezot konpleks nwayo, bann peptid transmembrane i enteronp kontinite LH1 otour, e par sa promot difizyon quinol/quinone ant RC ek konpleks cytochrome bc (1111, 13). plant fototrofik mov Rhodopseudomonas (Rps.) i en lorganizm model ki kapab konpran lenerzi ek transfer electron ki siport fotosintez. premye striktir kristal Rps. Model konpleks palustris RC-LH1 i RC, antoure par 15 loop LH1 eterodimerik, ki ganny enteronpe par en protein enkoni ki apel “Protein W” (14). Protein-W ti ganny idantifye koman RPA4402, ki en protein 10.5kDa ki pa'n ganny karakterize avek trwa helices transmembrane (TMH) (16). nou propoze pou renonm zenn rpa4402 ki kod protein W pou vin pufW pou li konsistan avek nomenklatir ki ganny servi pou bann zenn ki kod RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB) bann sou-yinite. I enteresan note ki protein-W i selman prezan dan apepre 10% RC-LH1, ki revel Rps. palustris i prodwi de diferan konpleks RC-LH1. La, nou raport bann striktir cryo-EM (cryo-EM) o rezolisyon de konpleks debaz, enn avek protein W e 14 αβ heterodimers, lot san protein W e en 16 Heterodimer LH1 loop fermen. nou striktir i reprezant en sanzman dan konprenezon konpleks RC-LH1 Rps. palustris, akoz nou'n analiz popilasyon omozenn sak varyant e annan sifizaman rezolisyon pou klerman donn sak peptid e bann pigman atase e bann lipid ek quinones relye. Konparezon sa bann striktir i montre ki sa trwa protein TMH-W ki pa'n ganny trouve dan okenn lezot konpleks RC-LH1 ziska prezan i zener en kanal kinon pou akseler lesanz kinon/kinon. En kantite sit atasman lipid ek quinone konserve in ganny idantifye, e nou'n devwal en nouvo sanzman konformasyonnel apre konbinezon quinone ek RC, ki kapab apropriye pour fotosistenm II (PSII) RC bann organizm fototrofik oksizenn. nou bann konklizyon i donn nouvo apersi lo kinetik lyezon ek lesanz quinone/quinolone dan konpleks nwayo RC-LH1 bann bakteri fototrofik mov.
pou fasilit en letid detaye lo sa de konpleks ki ganny trouve dan Rps. palustris, nou izol sak RC-LH1 par bann metod biosimik. Sa konpleks protein W-deficient (ki pou ganny refer avek koman ΔpufW) ti ganny pirifye avek sa strain ki ti napa sa zenn pufW (16), e zis en konpleks RC-LH1 ki kapab ganny prodwir. sa konpleks ki annan protein W i ganny prodwir par en souch. Protein W sa souch i ganny modifye avek en 10x His tag kot son C-terminus, pour ki sa konpleks ki konteni protein W i kapab efektivman ganny konbine avek laplipar protein W ki manke par imobiliz metal. Sa konpleks i efektivman separe (16) Affinity Chromatography (IMAC).
parey i ganny montre dan figir 1, tou le de konpleks i kontenir en trwa sou-younit RC (RC-L, RC-M ek RC-H) antoure par en lantenn LH1. striktir 2.80-A sa konpleks ki napa protein-W i montre 16 αβ heterodimers, ki form en loop LH1 fermen ki antour RC konpletman, ki pou ganny refer avek konman konpleks RC-LH116. striktir 2.65Å sa konpleks ki annan protein-W i annan en 14-heterodimer LH1 enteronpe par protein-W, ki pou ganny refer avek koman RC-LH114-W.
(A ek B) Reprezantasyon sirfas sa konpoze. (C ek D) bann pigman atase ki ganny eksprimen dan bann baton. (E ek F) Bann konpleks ki'n ganny obzerve lo sirfas sitoplazmik i annan bann peptid ek bann sou-yinite LH1 reprezante dan bann desen anime, e i ganny nimerote dan direksyon montrer sorti dan gap protein-W [konsistan avek nimero Rba. sphaeroides complex (13)]. pour LH1-α, kouler sa sou-unit protein i zonn; pour LH1-β, kouler sa sou-unit protein i ble; pour protein-W, protein i rouz; pour RC-H, i cyan; pour RC-L, i Oranz; pour RC-M, mazenta. bann kofakter i ganny reprezante par bann baton, ver i reprezant bann molekil BChl ek BPh a, mov i reprezant bann karotenoid, e zonn i reprezant bann molekil UQ10. (G ek H) Vi agrandi lo gap protein-W dan rezyon ekivalan konpleks RC-LH114-W (G) ek konpleks RC-LH116 (H). bann kofakter i ganny demontre dan laform ranpli lespas, quinone chelated i ganny demontre an ble. gap protein-W i ganny fer resorti par en laliny trase ble dan (G), e bann pti trou kot quinone/quinolol i difize lo bag LH116 i ganny fer resorti par en laliny trase nwanr dan (H).
Fig 1 (A ek B) i montre RC antoure par bann laranzman ouver ou fermen LH1αβ heterodimers, sakenn ki atas de BChl ek en karotenoid (Figure 1, C ek D). bann letid presedan in montre ki Rps i konpleks LH1. dan semen biosintetik spirulina xanthin, sa bann lespes i kontenir bann popilasyon melanze karotenoid (17). Sepandan, spiropyrroxanthin i karotenoid dominan e son dansite i satisfezan. Alor, nou'n swazir pou model spiroxanthin dan tou bann sit lyezon LH1. bann polipeptid alfa ek beta i bann TMH tousel avek bann rezyon eksteryer manbràn kourt (Figure 1, A, B, E, ek F). Malgre ki dansite 17 rezidi kot C-terminus pa ti ganny obzerve, polipeptid alfa ti ganny koupe sorti Met1 ziska Ala46 dan tou le de konpleks. β polypeptide ti ganny redwir sorti Gly4 pou vin Tyr52 dan RC-LH116, e sorti Ser5 pou vin Tyr52 dan RC-LH114-W. napa okenn dansite 3 ou 4 N-terminal ou 13 C-terminal rezidi ki ti ganny obzerve (Figure S1). analiz spektrometri mas lo konpleks RC-LH1 melanze ki ti ganny prepare avek sa souch sovaz ti montre ki sa rezyon ki ti manke ti rezilta en separasyon eterolog sa bann peptid (Figure S1 ek S2). Formilasyon N-terminal α-Met1 ti osi ganny obzerve (f). analiz in montre ki α-peptide i konpoze avek bann rezidi fMet1 ziska Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, e β-peptide i konpoze avek bann rezidi Ser2 ziska Ala53, ki an bonn akor avek map dansite EM tanperatir ba.
Kordinasyon α-His29 ek β-His36 i fer BChls fas a fas; sak αβ heterodimer i rasanble avek son bann vwazen pou form en boukl ouver (RC-LH114-W) oubyen en boukl fermen (RC-LH116) otour RC The exciton coupled pigment array (Figure 1, C and D). Konpare avek 877 nm band RC-LH114-W, 880 nm absorption red shift RC-LH116 i 3 nm (Figure 2A). Sepandan, spektak dikroism sirkiler i preski parey (Figure 2B), ki endike ki malgre i annan en diferans kler ant bann loop ouver ek fermen, lanvironnman lokal BChls i tre parey. redshift abzorbsyon i kapab rezilta mouvman termik redwir e stabilite ogmante lo sa boukl fermen (18, 19), sanzman dan koupling pigman koze par sa boukl fermen (20, 21), oubyen en konbinezon sa de lefe (11).
(A) Spektrom abzorbsyon ultraviolet/vizib/pre-enfrarouz, ki bann pik i ganny marke avek zot bann pigman korespondan e normalize avek pik BPh a 775 nm. (B) Spektrom dikroism sirkiler normalize avek absorbans BChl a 805 nm. (C ek D) bann spektr ΔA selekte dan bann spektr abzorbsyon rezourd dan letan konpleks RC-LH114-W (C) ek konpleks RC-LH116 (D). pou en pli bon konparabilite, tou bann spektak i ganny normalize a ∆A of −A a 0.2 ps. (E) To oksidasyon sitokrom c2 apre iradyasyon dan prezans diferan konsantrasyon UQ2 (vwar Fig S8 pou lenformasyon brit). (F) Dan bann selil ki'n grandi anba lalimyer ba, mwayen ou o lentansite (10, 30 ou 300μMm-2 s-1, respektivman), bann sou-yinite protein W ek RC-L dan konpleks pirifye e rapor manbràn separe. determin nivo protein par electrophoresis gel SDS-polyacrylamide ek immunoassay (vwar figir S9 pou lenformasyon brit). determin rapor par rapor avek konpleks RC-LH114-W pirifye. rapor stoikiometrik RC-L avek protein-W sa konpleks i 1:1.
bann BChls dan pozisyon 1 dan αβ14 loop deforme RC-LH114-W (Figure 1, A, C, ek E) i pli pros avek doner primer RC (P) par 6.8Å ki bann BChls ekivalan dan RC-LH116 (Figure. 1, B, D, ek F, ek S3); sepandan, kinetik abzorbsyon tranzitwar sa de konpleks i montre ki pour RC-LH114-W ek RC-LH116, bann konstan letan transfer lenerzi eksitasyon sorti LH1 pour al RC i 40 ±4 e 44±3 ps (Figure 2). , C ek D, Fig S4 ek latab S2). I osi napa okenn diferans enportan dan transfer elektronik dan RC (Figure S5 ek teks siplemanter relye). nou soupsonnen ki korespondans pros letan transfer lenerzi ant LH1 ek RC-P i akoz zistans, ang ek lenerzi potansyel parey laplipar BChl dan sa de loop LH1. i paret ki eksplor patern lenerzi LH1 pou ariv lo zistans minimonm i pa pli vit ki transfer lenerzi direk sorti dan bann sit sou-optimal pou al RC. sa open-loop LH1 loop dan RC-LH114-W i kapab osi sibir en mouvman termik ensinifyan anba bann kondisyon tanperatir ba pou analiz striktirel, e i annan en konformasyon bag αβ14 pli long a tanperatir lasanm sorti dan zistans pigmantasyon βBChls dan pozisyon RC 1.
Konpleks RC-LH116 i kontenir 32 BChls ek 16 carotenoids, e son laranzman zeneral i parey avek sa ki ganny obtenir avek Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB strain (IDC 797) (IDC) ek alg ver (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Apre lalinyman, zis bann pti devyasyon dan pozisyon bann αβ heterodimers ki ti ganny obzerve, sirtou 1-5, 15, e 16 (Figure S6). prezans protein-W i annan en lenpak enportan lo striktir LH1. son trwa TMH i konekte par bann pti boukl, avek N-terminal lo kote lumen sa konpleks e C-terminal lo kote sitoplazmik (Zis 1A ek 3, A ziska D). Protein-W i an gran parti idrofob (Figure 3B), e TMH2 ek TMH3 i enterakte avek LH1αβ-14 pou form en sirfas transmembrane (Figure 3, B ek E ziska G). sa lenterfas i prensipalman konpoze avek bann rezidi Phe, Leu ek Val dan rezyon transmembrane. sa bann rezidi i ganny anpile avek bann asid amine idrofob ek bann pigman αβ-14. serten rezidi poler i osi kontribye dan enteraksyon, enkli sa lyezon idwozenn ant W-Thr68 ek β-Trp42 lo sirfas sa kavite konpleks (Figure 3, F ek G). lo sirfas sitoplasm, Gln34 i adjacent avek group keto bann karotenoid αβ-14. an plis, molekil n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ti ganny rezourd, e son lake idrofob ti prolonze ziska lenterfas ant protein-W ek αβ-14, e lake lipid i kapab ganny trouve dan lekor. nou'n osi remarke ki bann rezyon rezolisyon C-terminal protein W ek RCH i tre pros, me pa dan lanpler form bann enteraksyon spesifik (Figure 1, A ek E). Sepandan, i kapab annan bann enteraksyon dan bann asid amine C-terminal ki pa ankor rezourd sa de protein, ki kapab fourni en mekanizm pou rekritman protein-W pandan lasanblaz konpleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, ki fer fas avek lenterfas avek LH1αβ14 dan laform kartoun, i annan en lasenn kote an form baton (rouz), ki ganny demontre dan en parti dyagram potansyel elektrostatik (sirfas gri transparan avek en nivo kontour 0.13). (B) Protein-W reprezante par en sirfas kouler idrofob. bann landrwa poler ek sarze i ganny demontre an cyan, bann landrwa idrofob i ganny demontre an blan, e bann landrwa for idrofob i ganny demontre an oranz. (C ek D) Protein-W reprezante dan desin anime, son loriantasyon i parey dan (A) (C), e vire par 180° (D). dapre pozisyon dan sekans, bann rezidi ki kapab ganny distinge i adopte en kouler larkansyel, kot N-terminal i ble e C-terminal i rouz. (E) Protein-W dan menm pwennvi ki dan (A), e bann rezidi kot lenterfas protein-W:LH1 i ganny reprezante par bann baton avek bann mark atase. (F) Protein-W i ganny vire 90° par rapor avek (E) e LH1αβ14 dan reprezantasyon kartoun, e par rapor avek bann rezidi enterfas dan reprezantasyon bar. bann rezidi ki anpandan sorti dan beta polypeptide i ganny marke. sa kofakter i ganny montre koman en bar ki koresponn avek kouler figir 1, β-DDM dekonpoze i ganny montre an gri, e loksizenn i ganny montre an rouz. (G) Sa vi dan (F) i ganny vire 180°, avek bann rezidi prominen sa polipeptid alfa ki'n ganny marke.
Protein-W i ranplas en αβ heterodimer (sa 15enm dan Fig 1F), e alor anpes loop fermen e baskil sa premye trwa αβ heterodimer. I ti ganny obzerve ki ang enklinasyon maksimonm premye αβ-1 heterodimer par rapor avek film normal ti 25° a 29° (Figure 1, A ek E), ki ti ganny formen par enklinasyon 2° a 8° αβ-1 dan RC A sharp contrast-LH116 (Figure 1, B ek F). dezyenm ek trwazyenm eterodimer i enkline a 12° a 22° e 5° a 10°, respektivman. Akoz lobstak sterik RC, pant αβ-1 pa enkli dezyenm per αβ (ki koresponn avek 16enm αβ dan Fig 1F), e alor form en gap kler dan bag LH1 (Figure 1, A ek E) . akoz mankman de αβ heterodimers, akonpannyen par pert kat BChl ek de carotenoids, okenn sa bann carotenoids pa atas avek sa subunit αβ-1 tord, ki an rezilta i annan en bag LH114-W ki kontenir 13 carotenoids Vezetaryen e 28 BChls. bann estimasyon rezolisyon lokal sa de konpleks dan rezyon αβ1 a 7 i pli ba ki pour larestan loop LH1, ki kapab reflekte plastisite eneren sa sou-unit LH1 adjacent avek sit RC QB (Figure 4) .
bann portre RC-LH114-W (A ek B) ek RC-LH116 (C ek D) i ganny montre lo menm vi anler/kote (A ek B) (A ek C) e sirfas kavite Fig. 1. (B ek D). bann lakle kouler i ganny montre lo kote drwat.
Sel lezot karakteristik nwayo konpleks avek en rapor stoikiometrik 1:14 se Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Sepandan, protein W ek PufX napa okenn omolozi evidan, e i annan en lenpak enportan lo zot striktir LH1 respektiv. PufX i en sel TMH avek en domenn sitoplazmik N-terminal ki enterakte avek kote sitoplazmik sa sou-unit RC-H (13) dan en pozisyon ki koresponn avek Rps. palustris LH116αβ-16. PufX i kree en kanal pou lesanz quinone/quinolone ant RC-LH1 ek konpleks cytochrome bcl e i prezan dan tou Rba. konpleks nwayo sphaeroides (13). malgre ki lenterfas monomer-monomer i dan Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX i trouve dan pozisyon atasman protein W dan RC-LH114-W, e sa gap ki ganny enfliyanse par PufX ek protein-W i dan en pozisyon ekivalan (Figure S7A). sa gap dan RC-LH114-W i osi anliny avek sa kanal quinone ipotetik (8) Pseudomonas rosea LH1, ki ganny formen par bann peptid ki pa relye avek protein W oubyen PufX (Figure S7B). an plis, kanal quinone dan Blc. LH1 ver emerald ki'n ganny formen par eksklir en sou-unit γ (7) i trouve dan en pozisyon parey (Figure S7C). Menm si i ganny medye par diferan protein, laparans sa bann kanal quinone/quinolol dan en pozisyon komen dan konpleks RC-LH1 i paret en legzanp levolisyon konverzan, ki endike ki sa gap kree par protein W i kapab azir koman en kanal quinone.
sa gap dan sa LH114-W loop i permet formasyon en rezyon manbràn kontinyel ant lespas entern sa konpleks RC-LH114-W ek sa manbràn an gro (Figure 1G), olye konekte sa de domenn atraver en por protein parey dan bann protein. konpleks RC-LH116 i parey en Tch fermen. Konpleks parey zegwiy (22) (Figure 1H). Vi ki difizyon quinone atraver manbràn i pli vit ki difizyon atraver kanal protein etrwat, sa boukl LH114-W ouver i kapab permet en turnover RC pli vit ki sa boukl LH116 fermen, e difizyon quinone dan RC i kapab pli restrikte. Pou teste si protein W i afekte konversyon bann quinones atraver RC, nou ti fer en tes oksidasyon sitokrom lo en serten konsantrasyon ubiquinone 2 (UQ2) (en analog UQ10 natirel avek en lake isoprene pli kourt) (Figure 2E). Malgre ki prezans quinone chelated i anpes determinasyon presi konstan Michaelis aparan (RC-LH114-W ek RC-LH116 i apropriye pour 0.2±0.1μM e 0.5±0.2μM, respektivman), to maksimonm RC-LH114-W ( 4.6±0.6±0.2μM) i s-1-1. 28±5% pli gran ki RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
nou ti inisyalman estimen ki protein-W i prezan dan apepre 10% sa konpleks nwayo (16); isi, bann to lokipasyon bann selil krwasans dan lalimyer ba, lalimyer mwayen, e dan lalimyer o i 15±0.6%, 11±1% e 0.9±0.5, respektivman % (Figure 2F). Konparezon kantitatif spektrometri mas ti montre ki ladisyon tag istidin pa ti redwir labondans relatif protein-W konpare avek bann souch sovaz (P = 0.59), alor sa bann nivo pa en artefak protein-W modifye (Figure S10). Sepandan, sa lokipasyon ba protein-W dan konpleks RC-LH1 i kapab les serten RCs vire a en to akselere, e alor mitigate lesanz quinone/quinolone pli dousman dan konpleks RC-LH116. nou'n remarke ki sa o to lokipasyon lalimyer i enkonsistan avek bann lenformasyon transkriptomik resan, ki endike ki lekspresyon zenn pufW i ogmante anba lalimyer for (Figure S11) (23). Diferans ant transkripsyon pufW ek lenkorporasyon protein-W dan konpleks RC-LH1 i konfizan e i kapab reflekte regilasyon konpleks sa protein.
dan RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) e 29 molekil β-DDM i ganny allocate e modele ladan 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG e 22 DMD. RC-LH116 (Figure 5, A ek B). dan sa de striktir, CDL i preski trouve lo kote sitoplasmik sa konpleks, tandis ki POPC, POPG ek β-DDM i plizoumwen trouve lo kote liminal. De molekil lipid ek deterzan ti ganny izole dan rezyon αβ-1 a αβ-6 dan konpleks RC-LH114-W (Figure 5A), e senk ti ganny izole dan rezyon ekivalan RC-LH116 (Figure 5B ). plis lipid ti ganny trouve lo lot kote sa konpleks, prensipalman CDL, akimile ant RC ek αβ-7 ziska αβ-13 (Figure 5, A ek B). Lezot lipid ek deterzan ki'n ganny rezourd striktirel i ganny trouve an deor bag LH1, e bann lasenn asil byen rezourd i al ant bann sou-yinite LH1, ki'n ganny dezinyen koman β-DDM dan RC-LH114-W, e defini koman β-DDM dan en melanz RC A β-DDM ek PO-LH116. bann pozisyon parey bann lipid chelating ek bann deterzan dan nou striktir i endike ki zot bann sit atasman fizyolozikman relevan (Figure S12A). bann pozisyon bann molekil ekivalan dan Tch i osi annan en bon konsistans. dous e tris. Strain 970 RC-LH1s (Figure S12, B to E) (9, 12) e bann rezidi lyezon idwozenn dan group latet lipid ti montre ase bon konservasyon dan laliny sekans (Figure S13), ki endike ki CDL konserve ki atase avek RC (24), sa bann sit i kapab ganny konserve dan konpleks RCH-LH1.
(A ek B) bann peptid RC-LH114-W (A) ek RC-LH116 (B) i ganny reprezante par bann desen anime, e bann pigman i ganny reprezante par bann baton, an servan laranzman kouler dan Fig 1. Bann lipid i ganny montre an rouz, e bann deterzan i ganny montre an gri. UQ ki atase avek bann sit RC QA ek QB i zonn, tandis ki UQ izole i ble. (C ek D) Menm pwennvi ki (A) ek (B), avek bann lipid ki'n ganny omet. (E ziska G) Vi agrandi lo Q1(E), Q2(F) e Q3(G) sorti kot RC-LH116, avek bann lasenn kote ki enfliyans kanmarad. bann lyezon idwozenn i ganny montre koman bann laliny pwente nwanr.
dan RC-LH116, tou le de RC QA ek QB UQ, ki partisip dan transfer electron dan prosesis separasyon sarz, i ganny dekonpoze dan zot bann sit atasman. Sepandan, dan RC-LH114-W, QB quinone pa ankor ganny rezourd e pou ganny diskite an detay anba. An plis ki QA ek QB quinones, de molekil UQ chelated (ki trouve ant bann bag RC ek LH1) i ganny allocate dan striktir RC-LH114-W dapre zot bann group latet byen rezourd (ki trouve dan Q1 ek Q2, respektivman). lespas). Fig 5C). de younit isoprene i ganny donnen avek Q1, e map dansite i rezourd 10 lakel isoprene konplet Q2. dan striktir RC-LH116, trwa molekil UQ10 chelated (Q1 ziska Q3, Figure 5D) ti ganny rezourd, e tou bann molekil i annan en dansite kler atraver lake (Figure 5, D ziska G). dan sa de striktir, bann pozisyon bann group latet quinone Q1 ek Q2 i annan en konsistans ekselan (Figure S12F), e zot enterakte selman avek RC. Q1 i trouve kot larantre W gap RC-LH114-W (Figure 1G ek 5, C, D ek E), e Q2 i trouve obor sit atasman QB (Figure 5, C, D) ek F). bann rezidi L-Trp143 ek L-Trp269 ki'n ganny konserve i tre pros avek Q1 ek Q2 e i donn bann enteraksyon potansyel π-stacking (Figure 5, E ek F, e Figure S12). L-Gln88, 3.0 Å sorti dan loksizenn distal Q1, i fourni en lyezon idwozenn for (Figure 5E); sa rezidi i ganny konserve dan tou RC eksepte sa relasyon pli lwen (Figure S13). L-Ser91 i ganny ranplase par Thr dan laplipar lezot RC (Figure S13), i 3.8 Angstroms avek metil loksizenn Q1, e i kapab fourni bann lyezon idrozenn feb (Figure 5E). Q3 pa paret annan en enteraksyon spesifik, me i trouve dan rezyon idrofob ant sou-unit RC-M ek sou-unit LH1-α 5 a 6 (Figure 5, D ek G). Q1, Q2 ek Q3 oubyen bann quinones chelated pros in osi ganny rezourd dan Tch. Dous, Trv. souch 970 ek Blc. striktir iris (9, 10, 12) i montre en sit atasman kinon oksilyer konserve dan konpleks RC-LH1 (Figure S12G). Sa senk UQ dekonpoze dan RC-LH116 i an bonn akor avek 5.8±0.7 sak konpleks determinen par kromatografi likid o performans (HPLC), tandis ki sa trwa UQ dekonpoze dan RC-LH114-W i pli ba ki valer mezire 6.2±0.3 (Fig. S14) i endike ki i annan bann molek ki pa rezourd dan UQ. striktir.
bann polipeptid pseudo-simetrik L ek M i sakenn kontenir senk TMH e i form en eterodimer ki konbin en dimer BChl, de monomer BChl, de monomer bakteriofaz (BPh), e en non-Heme iron ek enn ou de molekil UQ10. atraver prezans bann lyen idwozenn lo group keton terminal e son akimilasyon koni dan Rps, bann karotenoid i ganny enkorpore dan M-suunit, ki apel cis-3,4-dehydroorhodopin. Lespes (25). domenn manbràn eksteryer RC-H i ankre avek manbràn par en sel TMH. striktir RC an zeneral i parey avek sa trwa sou-unit RC bann lespes relye (tel ki Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). bann makrosikl BChl ek BPh, backbone karotenoid ek non-heme iron i sirkile dan ranze rezolisyon sa bann striktir, parey group latet UQ10 kot sit QA e quinone QB kot RC-LH116 (Figure S15).
disponibilite de striktir RC avek diferan to lokipasyon sit QB i donn en nouvo loportinite pou egzamin bann sanzman konformasyonnel konsistan ki akonpanny lyezon QB quinone. dan konpleks RC-LH116, QB quinone i trouve dan pozisyon “proksimal” konpletman atase (26), me separasyon RC-LH114-W napa QB quinone. napa QB quinone dan RC-LH114-W, ki sirprenan akoz sa konpleks i aktiv, plis ki sa konpleks RC-LH116 avek QB quinone striktirelman rezourd. Malgre ki sa de bag LH1 i chelate apepre sis quinones, senk i striktirelman rezourd dan bag RC-LH116 fermen, tandis ki zis trwa ki striktirelman limite dan bag RC-LH114-W ouver. Sa dezord striktirel ogmante i kapab reflekte ranplasman pli vit bann sit QB RC-LH114-W, kinetik quinone pli vit dan konpleks, e probabilite ogmante pour travers sa boukl LH1. Nou sizere ki mankman UQ dan sit RC QB RC-LH114-W i kapab rezilta en konpleks pli konpleks e pli aktiv, e sit QB RC-LH114-W in ganny konzele imedyatman dan turnover UQ Staz spesifik (lantre sit QB in ganny fermen) i reflekte konformasyon sa aktivite.
san QB, rotasyon akonpannyman L-Phe217 dan en pozisyon ki enkonpatib avek atasman UQ10, akoz i pou koz en kolizyon spasyal avek premye younit isoprene dan lake (Figure 6A). an plis, bann sanzman konformasyonnel prensipal evidan i evidan, sirtou sa helix de (helix kourt dan sa loop ant TMH D ek E) kot L-Phe217 i ganny bouze dan pos lyezon QB e rotasyon L-Tyr223 (Figure 6A ) Pour kas lyezon idwozenn avek kad lyezon M-A4 e ferm lantre lyezon QB sit (Figure 6B). Helix de pivot kot son baz, Cα L-Ser209 i ganny bouze par 0.33Å, tandis ki L-Val221Cα i ganny bouze par 3.52Å. napa okenn sanzman obzervab dan TMH D ek E, ki siperenpoze dan tou le de striktir (Figure 6A). otan ki nou konnen, sa i premye striktir dan RC natirel ki ferm sit QB. en konparezon avek striktir konplet (QB-bound) i montre ki avan ki quinone i redwir, en sanzman konformasyonnel i neseser pou fer li antre dan quinone. L-Phe217 i vire pou form en enteraksyon π-stacking avek group latet quinone, e sa helix i bouz an deor, permet skelet L-Gly222 ek lasenn kote L-Tyr223 pou form en rezo lyezon idrozenn avek en striktir lyezon idrozenn stab (Figure 6, A ek C).
(A) Desin anime ki sirkile avek ologram (lasenn L, lasenn oranz/M, mazenta) ek striktir apo (gri), dan ki bann rezidi kle i ganny demontre dan laform en reprezantasyon parey en baton. UQ10 i ganny reprezante par en bar zonn. sa laliny pwentiye i endik bann lyezon idrozenn ki'n ganny formen dan sa striktir antye. (B ek C) Reprezantasyon sirfas apolipoprotein ek striktir bag antye, ki fer resorti loksizenn lasenn kote L-Phe217 an ble e L-Tyr223 an rouz, respektivman. sa sou-unit L i oranz; bann sou-yinite M ek H pa kouler. (D ek E) Apolipoprotein (D) ek antye (E) RC QB sites [kouler par (A) respektivman] ek Thermophilus thermophilus PSII (ver, ble avek plastic quinone; PDB ID: 3WU2) Align (58).
san ekspekte, menm si plizyer striktir QB-deficient RCs san LH1 i disponib, bann sanzman konformasyonnel obzerve dan sa letid pa'n ganny raporte oparavan. Sa i enkli striktir deplesyon QB sorti kot Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ek Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tousala i preski parey avek zot striktir QB an zeneral. lenspeksyon pros 3PRC in revele ki bann molekil deterzan LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) i atase kot larantre pozisyon QB, ki kapab anpes rearanzman dan en konformasyon fermen. Menm si LDAO pa dekonpoze dan menm pozisyon dan 1EYS ou 1OGV, sa bann RC i ganny prepare an servan menm deterzan e alor i kapab prodwi menm lefe. striktir kristal Rba. Sphaeroides RC ko-kristaliz avek cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) i osi paret annan en sit QB fermen. Sepandan, dan sa ka, rezyon N-terminal polipeptid RC-M (ki enterakte avek sit atasman QB atraver lyezon H rezidi Tyr lo eliks Q) i adopte en konformasyon pa natirel, e sanzman konformasyonnel QB pa ganny eksplore plis (30 ). Sa ki rasir se ki nou pa'n vwar sa kalite deformasyon polipeptid M dan striktir RC-LH114-W, ki preski parey avek rezyon N-terminal RC-LH116 RC. I devret osi ganny note ki apre eradikasyon lantenn LH1 baze lo deterzan, bann RC apolipoprotein dan PDB ti ganny rezourd, ki ti elimin bann basen quinone entern ek lipid dan sa gap ant RC ek sirfas entern bag LH1 otour (31, 32). RC i reste fonksyonnel akoz i retenir tou bann kofakter, eksepte pour QB quinone ki kapab ganny dekonpoze, ki mwen stab e i souvan perdi pandan prosesis preparasyon (33). an plis, i koni ki retir LH1 ek bann lipid siklik natirel dan RC i kapab annan en lenpak lo bann fonksyon, tel ki lavi pli kourt sa leta P+QB separe par sarz (31, 34, 35). Alor, nou pe spekile ki legzistans sa bag LH1 lokal otour RC i kapab mentenir sa sit QB “fermen”, e par sa prezerv lanvironnman lokal obor QB.
Malgre ki apolipoprotein (san QB quinone) ek striktir konplet i reprezant zis de snapshot turnover sit QB, olye en seri levennman, i annan lendikasyon ki sa binding i kapab ganny gate pou anpes rebinding par hydroquinone Pou anpes lenhibisyon sibstra. enteraksyon quinolol ek quinone obor sit QB apolipoprotein i kapab diferan, ki anmenn ver son rezet par RC. in ganny propoze depi lontan ki bann sanzman konformasyonnel i zwe en rol dan lyezon ek rediksyon bann quinones. abilite bann RC konzele pou redwir quinones apre adaptasyon fernwanr i ganny afekte (36); kristalografi reyon-X i montre ki sa domaz i akoz bann quinones QB ki’n ganny kwense dan en konformasyon “distal” apepre 4.5 Å avek pozisyon proksimal aktiv (26) , 37). nou sizere ki sa konformasyon lyezon distal i en portre leta entermedyer ant apolipoprotein ek striktir bag konplet, ki swiv enteraksyon inisyal avek quinone e louvertir sit QB.
tip II RC ki ganny trouve dan konpleks PSII serten bakteri fototrofik e cyanobacteria, alg ek plant i annan konservasyon striktirel e fonksyonnel (38). Lalinyman striktirel montre dan Fig 6 (D ek E) i met lanfaz lo similarite ant PSII RCs ek sit QB sa konpleks RC bakteriel. sa konparezon in depi lontan en model pou etidye bann sistenm pros ki relye avek lyezon ek rediksyon quinone. bann piblikasyon presedan ti sizere ki bann sanzman konformasyonnel i ganny akonpannyen par rediksyon PSII bann quinones (39, 40). Alor, an konsideran konservasyon evolisyonner RC, sa mekanizm atasman ki pa ti'n ganny obzerve oparavan i kapab osi aplikab pour sit QB PSII RC dan bann plant fototrofik oksizenn.
Rps ΔpufW (unlabeled pufW deletion) ek PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W expressed from the natural pufW locus) strains. palustris CGA009 ti ganny dekrir dan nou travay presedan (16). Sa bann souch ek paran sovaz izozenik ti ganny rekipere dan frizer par streak en pti nonm selil lo PYE (sakenn 5 g lit -1) (stoke dan LB a -80 °C, ki ti annan 50% ( w/v) gliserol) protein, ekstrak lelven ek succinate) agar [1.5%/v) plate. sa plak ti ganny enkile pandan lannwit dan fernwanr a tanperatir lasanm anba bann kondisyon anaerobik, e apre i ti ganny eklere avek lalimyer blan (~50 μmolm-2 s-1) fourni par bann glob alozenn OSRAM 116-W (RS Components, UK) pour 3 a 5 zour ziska ki en sel koloni ti aparet. En sel koloni ti ganny servi pou inokil 10 ml medyonm M22+ (41) konplemante avek 0.1% (w/v) lasid casamino (ki pou ganny refer avek koman M22 apre). sa kiltir ti ganny kiltive anba bann kondisyon loksizenn ba dan fernwar a 34°C avek tranbleman a 180 rpm pou 48 erdtan, e apre 70 ml sa kiltir ti ganny inokile anba menm kondisyon pou 24 erdtan. En kiltir semi-aerobik avek en volim 1 ml i ganny servi pou inokil 30 ml medyonm M22 dan en boutey an ver transparan iniversel 30 ml e iradye avek lazitasyon (~50μmolm-2 s-1) pou 48 erdtan par lafors magnetik steril Stirring rod. Apre 30 ml sa kiltir ti ganny inokile avek apepre 1 lit kiltir anba menm kondisyon, ki ti apre ganny servi pou inokile apepre 9 lit kiltir ki ti ganny eklere a ~200 μmolm-2 s-1 pou 72 erdtan. bann selil ti ganny rekolte par santrifigasyon a 7132 RCF pou 30 minit, resuspend dan ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), e stoke a -20°C ziska ler i neseser.
Apre ki in dekonzeste, azout serten kristal deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) e de Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) avek bann selil ki'n ganny resuspend. dan en selil presyon franse 20,000 psi (Aminco, USA), bann selil ti ganny deranze 8 a 12 fwa. Apre ki in retir bann selil ki pa'n kase e bann debri ki pa kapab fonn par santrifigasyon a 18,500 RCF pour 15 minit a 4°C, sa manbràn ti ganny presipite sorti dan liza pigmante par santrifigasyon a 113,000 RCF pour 2 erdtan a 43,000°C. zet sa fraksyon solib e resuspend sa manbràn kouler dan 100 a 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) e omozenize ziska ki napa okenn agregat vizib. sa manbràn sispann ti ganny enkile dan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ki ti annan 2% (w/v) β-DDM pour 1 erdtan dan fernwanr a 4°C avek en melanz dous. apre santrifiz a 70°C pou fonn 150,000 RCF a 4°C pou 1 erdtan pou retir bann ensolib rezidyel.
Manbràn solubilizan sorti dan souch ΔpufW ti ganny aplike lo en kolonn lesanz ion 50 ml DEAE Sepharose avek trwa volim kolonn (CV) tampon atasman [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ki konteni 0.03% (w / v) β-DDM]. lav sa kolonn avek de tampon CV, e apre lav sa kolonn avek de tampon ki annan 50 mM NaCl. Konpleks RC-LH116 ti ganny elye avek en gradient lineer 150 a 300 mM NaCl (dan en tampon lyezon) lo 1.75 CV, e larestan konpleks lyezon ti ganny elye avek en tampon lyezon ki ti annan 300 mM NaCl lo 0.5 CV. kolekte spektak abzorbsyon ant 250 ek 1000 nm, gard sa fraksyon avek rapor absorbans (A880/A280) plis ki 1 a 880 a 280 nm, dilye li de fwa dan tampon atasman, e servi menm prosedir ankor lo kolonn DEAE lo pirifikasyon. Dilye bann fraksyon avek bann rapor A880/A280 pli o ki 1.7 e bann rapor A880/A805 pli o ki 3.0, fer trwazyenm tour lesanz ion, e retenir bann fraksyon avek bann rapor A880/A280 pli o ki 2.2 e bann rapor A880/A805 pli o ki 0.0.0. Sa konpleks parsyelman pirifye ti ganny konsantre a ~2 ml dan en filter santrifugal Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), e ti ganny mete lo en kolonn eksklizyon groser Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ki ti annan 200 mM NaCl, e apre ti ganny eluye dan menm tampon. CV. kolekte bann spektr abzorbsyon sa fraksyon eksklizyon groser, e konsantre bann spektr abzorbsyon avek bann rapor A880/A280 par lao 2.4 e bann rapor A880/A805 par lao 5.8 a 100 A880, e imedyatman servi zot pou preparasyon ou stokaz grid cryo-TEM Gard a -80°C ziska ler i neseser.
Manbràn solubilizan sorti dan souch PufW-His ti ganny aplike lo en kolonn 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ki konteni 200 mM NaCl ek 0.03% (w/w)) dan tampon IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. sa kolonn ti ganny lave avek senk CV tampon IMAC, e apre avek senk CV tampon IMAC ki ti annan 10 mM istidin. konpleks nwayo ti ganny elye dan kolonn avek senk tampon IMAC ki ti annan 100 mM istidin. Sa fraksyon ki konteni konpleks RC-LH114-W i ganny konsantre a ~10 ml dan en tenk ki'n ganny melanze ekipe avek en filter Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), dilye 20 fwa avek binding buffer, e apre azoute avek 25 ml Dan kolonn DEAE Sepharose, kat CVs buffer i ganny servi avek tampon b davans. lav sa kolonn avek kat tampon lyezon CV, apre elye sa konpleks lo wit CV lo en gradient lineer 0 a 100 mM NaCl (dan tampon lyezon), e larestan kat CV ki kontenir 100 mM tampon lyezon bann konpleks rezidyel elye lo klorid sodyum konbine avek rapor A/8880A e pli o ki 2004. rapor A880/A805 pli o ki 4.6 fraksyon ti ganny konsantre a ~2 ml dan en filter santrifugal Amicon 100,000 MWCO, e ranpli avek 1.5 CV IMAC davans. kolekte bann spektr abzorbsyon bann fraksyon grander-eksklizyon e konsantre bann spektr abzorbsyon avek bann rapor A880/A280 par lao 2.1 e bann rapor A880/A805 par lao 4.6 a 100 A880, ki ganny servi imedyatman pou preparasyon grid TEM konzele oubyen stoke a -80°C ziska ler i neseser.
en frizer imersyon Leica EM GP ti ganny servi pou prepar bann grid TEM tanperatir ba. Sa konpleks ti ganny dilye dan en tampon IMAC ziska A880 de 50, e apre 5μl ti ganny mete lo en nouvo may kwiv kouver avek karbonn QUANTIFOIL 1.2/1.3 glow-discharged (Agar Scientific, UK). Enkuba grid a 20°C e 60% limidite relatif pou 30 s, apre eswiy li sek pou 3 s, e apre tenny li dan etan likid a -176°C.
Lenformasyon konpleks RC-LH114-W ti ganny rikorde lo eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) avek en mikroskop Titan Krios, ki mars a en tansyon akselerasyon 300kV, avek en magnifikasyon nominal 130,000× e en lenerzi Choose gap 200V. en Gatan 968 GIF Quantum avek detekter pik K2 ti ganny servi pou rikord bann zimaz dan mod konte pou kolekte lenformasyon. groser piksel kalibre i 1.048Å, e to doz i 3.83 e-Å-2s-1. kolekte sa film dan 11 segonn e diviz li an 40 parti. servi sa landrwa kouver avek karbonn pou re-konsantre mikroskop, e apre kolekte trwa film par trou. an tou, 3130 film ti ganny kolekte, avek bann valer dekonsantrasyon ant -1 ek -3μm.
Lenformasyon pour konpleks RC-LH116 ti ganny kolekte an servan menm mikroskop kot Laboratwar Biostriktir Asterbury (Liniversite Leeds, UK). Lenformasyon ti ganny kolekte dan mod konte avek en magnifikasyon 130 k, e groser piksel ti ganny kalibre a 1.065 Å avek en doz 4.6 e-Å-2s-1. sa film ti ganny rikorde dan 12 segonn e divize an 48 parti. an tou, 3359 film ti ganny kolekte, avek bann valer dekonsantrasyon ant -1 ek -3μm.
tou prosesis lenformasyon i ganny fer dan pipeline Relion 3.0 (42). servi Motioncorr 2 (43) pou koriz mouvman reyon par pwa doz, e apre servi CTFFIND 4.1 (44) pou determin paramet CTF (kontras transfer fonksyon). bann fotomikrograf tipik apre sa bann staz prosesis inisyal i ganny montre dan figir 2. S16. sa model seleksyon otomatik i ganny prodwir par selekte apepre 250 piksel 1000 partikil dan en kad 250 piksel e napa referans klasifikasyon de dimansyonnel (2D), e alor rezet sa bann klasifikasyon ki zwenn kontaminasyon lesantiyon oubyen napa okenn karakteristik ki kapab ganny detekte. Apre, seleksyon otomatik ti ganny fer lo tou bann mikrofoto, e RC-LH114-W ti 849,359 partikil, e konpleks RC-LH116 ti 476,547 partikil. Tou bann partikil selekte in pas atraver de tour klasifikasyon 2D non-referans, e apre sak kours, bann partikil ki zwenn rezyon karbonn, kontaminasyon lesantiyon, napa okenn karakteristik evidan oubyen partikil ki fortman sirkile i ganny rezete, ki an rezilta 772,033 (90.9%) e 359,678 (75.5) partikil i ganny servi pour klasifikasyon 3D 3D. RC-LH114-W ek RC-LH116 respektivman. model referans 3D inisyal ti ganny prodwir an servan metod desant gradient stokastik. An servan model inisyal koman en referans, bann partikil selekte i ganny klasifye an kat kategori dan 3D. An servan model dan sa kategori koman en referans, fer rafinnman 3D lo bann partikil dan pli gran kategori, apre servi filter 15Å low-pass inisyal pou kouver rezyon solvan, azout 6 piksel bann bor mou, e post-proses bann piksel pou koriz fonksyon transfer Gatan K2 peak Modulation lo detekter anler. Pour sa dataset RC-LH114-W, sa model inisyal ti ganny modifye par retir sa dansite for lo bor sa mask (dekonekte avek dansite konpleks nwayo dan UCSF Chimera). bann model ki rezilta (bann rezolisyon RC-LH114-W ek RC-LH116 i 3.91 e 4.16 Å, respektivman) i ganny servi koman en referans pou dezyenm tour klasifikasyon 3D. bann partikil ki'n ganny servi i ganny groupe dan laklas 3D inisyal e napa en korelasyon for avek vwazinaz. sirplis oubyen mank bann karakteristik striktirel evidan. Apre dezyenm tour klasifikasyon 3D, kategori avek pli o rezolisyon ti ganny selekte [Pour RC-LH114-W, en kategori i 377,703 partikil (44.5%), pour RC-LH116, i annan de kategori, ki fer en total 260,752 partikil (54.77% W), zot selman parey ler zot ganny aligne apre parey apre. rotasyon inisyal avek en pti diferans]. bann partikil selekte i ganny re-tire dan en bwat 400-piksel e rafinen par rafinnman 3D. sa mask solvan i ganny prodwir an servan sa filter inisyal 15Å low-pass, 3 piksel lagrandisman map e 3 piksel soft mask. An servan rafinnman CTF par partikil, koreksyon mouvman par partikil e dezyenm tour rafinnman CTF par partikil, rafinnman 3D, masking solvan e post-prosesis i ganny fer apre sak letap pou rafin plis ankor tekstir ki rezilta. An servan FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) valer koupe 0.143, rezolisyon bann model final RC-LH114-W ek RC-LH116 i 2.65 e 2.80Å, respektivman. kourb FSC model final i ganny montre dan figir 2. S17.
tou bann sekans protein i ganny telesarze sorti kot UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ti ganny servi pou konstrir en model omolozi RC, ki kontenir bann sekans protein RC-L, RC-M ek RC-H e striktir kristal Rba. sphaeroides RC ti ganny servi koman en template (PDB ID: 5LSE) (46). servi zouti “fit map” dan UCSF Chimera pou fit sa model ki’n ganny zenere avek sa map (47), amelyor striktir protein, e kofakter [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), enn ou de kalite UQ10 (U10), en non-heme iron (Fe) e en 34-hexa-hydrocarycoline (QAK)] servi Coot (48) pou azoute. Vi ki QAK pa disponib dan bibliotek monomer, i ti ganny parametrize an servan zouti eLBOW dan PHENIX (49).
apre, sou-yinite LH1 ti ganny konstrir. Inisyalman, zouti konstriksyon otomatik dan PHENIX (49) ti ganny servi pou otomatikman konstrir en parti sekans LH1 an servan map ek sekans protein LH1-α ek LH1-β koman input. selekte sa sou-unit LH1 pli konplet, tir li e met li dan Coot, azout sa sekans ki manke ladan, e rafin striktir antye avan azout de BCls a (BCL) ek en spirilloxanthin (CRT) [dapre Rps relevan Dansite konpleks LH1 ek konteni karotenoid koni. Lespes (17)]. Kopye sa sou-unit LH1 konplet, e servi UCSF Chimera “Docking Map Tool” pou atase dan sa landrwa non-model adjacent avek dansite LH1, e apre rafin li dan Coot; repet sa prosesis ziska ki tou bann sou-yinite LH1 in ganny modele. Pour striktir RC-LH114-W, par ekstrak dansite ki pa'n ganny allocate dan Coot, protein i ganny segmante avek bann konponan non-protein ki reste dan map USCF Chimera e zouti Autobuild i ganny servi pour etablir model inisyal, e bann sou-yinite ki reste (protein-W) Modeling. dan PHENIX (49). azout okenn sekans ki manke avek model ki rezilta dan Coot (48), e apre rafin sa sou-unit antye mannyelman. Larestan dansite ki pa'n ganny allocate i al avek konbinezon lipid (PDB monomer library ID of CDL = CDL, POPC = 6PL and POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) ek bann molekil UQ10 (U10). servi optimizasyon PHENIX (49) e optimizasyon mannyel dan Coot (48) pou perfeksyonn model inisyal konplet ziska ki statistik model ek kalite vizyel sa fit pa kapab ganny amelyore ankor. Finalman, servi LocScale (50) pou file map lokal, e apre fer plizyer lezot sikl modelizasyon dansite ki pa'n ganny allocate e optimizasyon otomatik e mannyel.
bann peptid respektiv, kofakter e lezot lipid ek kinon ki'n ganny anmare dan zot dansite respektiv i ganny montre dan bann figir 1 ek 2. S18 ziska S23. lenformasyon statistik lo model final i ganny montre dan latab S1.
amwen ki i ganny spesifye otreman, bann spektr abzorbsyon UV/Vis/NIR ti ganny kolekte lo en spektrofotomet Cary60 (Agilent, USA) a bann enterval 1 nm depi 250 nm ziska 1000 nm e en letan lentegrasyon 0.1s.
dilye sa lesantiyon dan en kivet kwarz avek en semen 2 milimet ziska A880 of 1, e kolekte spektak abzorbsyon ant 400 ek 1000 nm. bann spektr dikroik sirkiler ti ganny kolekte lo en spektropolarimet Jasco 810 (Jasco, Zapon) a bann enterval 1 nm ant 400 nm ek 950 nm a en to skann 20 nm min-1.
Koefisyan lekstinksyon moler i ganny determinen par dilye konpleks nwayo a en A880 apepre 50. Dilye volim 10μl dan 990μl tampon atasman oubyen metanol, e kolekte spektak abzorbsyon imedyatman pou minimiz degradasyon BChl. Konteni BChl dan sak lesantiyon methanol ti ganny kalkile par koefisyan lekstinksyon a 771 nm 54.8 mM-1 cm-1, e koefisyan lekstinksyon ti ganny determinen (51). Diviz konsantrasyon BChl ki'n ganny mezire par 32 (RC-LH114-W) ou 36 (RC-LH116) pou determin konsantrasyon konpleks nwayo, ki apre i ganny servi pou determin spektak abzorbsyon sa menm lesantiyon ki'n ganny kolekte dan koefisyan lekstinksyon tampon. paralel. Trwa mezir repete ti ganny pran pour sak lesantiyon, e absorbans mwayenn maksimonm BChl Qy ti ganny servi pour kalkilasyon. Koefisyan disparisyon RC-LH114-W mezire a 878 nm i 3280±140 mM-1 cm-1, tandis ki koefisyan disparisyon RC-LH116 mezire a 880 nm i 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 ti ganny kantifye dapre metod dan (52). an bref, faz ranverse HPLC (RP-HPLC) ti ganny fer an servan sistenm Agilent 1200 HPLC. Fonn apepre 0.02 nmol RC-LH116 ou RC-LH114-W dan 50μl 50:50 methanol:kloroform ki kontenir 0.02% (w/v) ferric chloride, e enzekte pre-ekilibre Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4mml fonn dan 1-1-min. 40°C dan solvan HPLC (80:20 methanol:2-propanol) lo en kolonn ×25 cm. fer elisyon izokratik dan en solvan HPLC pou sirvey absorbans a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) e 780 nm (BChl) pou 1 erdtan. pik dan kromatogram 275 nm a 25.5 minit ti ganny entegre, ki pa ti kontenir okenn lezot konpoze detektab. sa landrwa entegre i ganny servi pou kalkil lakantite moler UQ10 ki'n ganny tire an referans avek kourb kalibrasyon ki'n ganny kalkile apartir linjeksyon bann standar pir depi 0 ziska 5.8 nmol (Figure S14). sak lesantiyon ti ganny analize an trwa replika, e fot raporte i koresponn avek SD mwayenn.
En solisyon ki konteni konpleks RC-LH1 avek en abzorbsyon Qy maksimonm 0.1 ti ganny prepare avek 30 μM sitokrom leker seval redwir c2 (Merck, UK) e 0 a 50 μMUQ2 (Merck, UK). Trwa lesantiyon 1-ml ti ganny prepare a sak konsantrasyon UQ2 e enkile pandan lannwit dan fernwanr a 4°C pou asir adaptasyon konplet avek fernwanr avan mezir. sa solisyon ti ganny mete dan en spektrofotomet modiler OLIS RSM1000 ekipe avek en 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle e 0.6 mm outlet slits. en filter 600 nm i ganny mete kot larantre sa lesantiyon phototube e sa referans photomultiplier tube pou eksklir lalimyer eksitasyon. absorbans ti ganny monitor a 550 nm avek en letan lentegrasyon 0.15 s. Lalimyer eksitasyon i ganny emet sorti kot 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) atraver en kab fib optik a 90% lentansite atraver en kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) e i ganny emet avek sours lalimyer a en ang 90°. sa reyon mezir i opoze avek sa laglas pou retourn okenn lalimyer ki pa ti ganny abzorbe o konmansman par sa lesantiyon. sirvey absorbans 10 s avan lalimyer 50 s. Apre sa, absorbans ti ganny monitor ankor pour 60 s dan fernwanr pour evalye ziska ki degre quinolol i redwir spontaneman sitokrom c23 + (vwar Fig S8 pour lenformasyon brit).
lenformasyon ti ganny prosese par fit en to inisyal lineer dan 0.5 a 10 s (depandan lo konsantrasyon UQ2) e an mwayenn bann to tou le trwa lesantiyon a sak konsantrasyon UQ2. konsantrasyon RC-LH1 kalkile par koefisyan lekstinksyon respektiv ti ganny servi pou konverti to dan lefikasite katalitik, trase dan Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), e fit avek model Michaelis-Menten pou determin bann valer aparan Km ek Kcat.
Pour bann mezir abzorbsyon tranzitwar, lesantiyon RC-LH1 ti ganny dilye a ~2μM dan tampon IMAC ki ti annan 50 mM sodyum ascorbate (Merck, USA) ek 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). lasid askorbik i ganny servi koman en donater electron sakrifisyel, e tert-butaclofen i ganny servi koman en inhibiter QB pou asire ki donater prensipal RC i reste redwir (setadir, pa fotooksidaze) pandan prosesis mezir. apepre 3 ml lesantiyon i ganny azoute avek en selil ki pe vire (apepre 0.1 m an dyamet, 350 RPM) avek en longer semen optik 2 milimet pou asire ki lesantiyon dan semen laser i annan ase letan pou adaptasyon fernwanr ant bann batman leksitasyon. servi ~100-fs laser pulses pou anplifye sistenm laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) pou eksit lesantiyon a 880 nm a en to repetisyon 1 kHz (20 nJ pou NIR ou 100 nJ pou Vis). avan kolekte lenformasyon, ekspoz sa lesantiyon avek lalimyer eksitasyon pou apepre 30 minit. ekspoze pou koz inaktivasyon QA (posib redwir QA en fwa ou de fwa). Me silvouple note ki sa prosesis i reversib akoz apre en long peryod adaptasyon fernwanr, RC pou dousman retourn dan aktivite QA. En spektrometr Helios (Ultrafast Systems, USA) ti ganny servi pou mezir bann spektr tranzitwar avek en letan retar -10 a 7000 ps. servi lozisyel Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) pou degroup bann data set, apre zwenn e standariz. servi sa package lozisyel CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) pou servi sa data set konbine pou ganny bann spektr diferansyel relye avek dekonpozisyon, oubyen servi en fonksyon ki konvolv plizyer eksponan avek larepons lenstriman pou fit levolisyon spektral en sel longer vag dan Origin (OriginLab, USA).
parey in ganny mansyonnen pli o (53), en film fotosintetik ki annan konpleks LH1 ki napa lantenn RC e periferik LH2 ti ganny prepare. sa manbràn ti ganny dilye dan 20 mM tris (pH 8.0) e apre ti ganny mete dan en kivet kwars avek en semen optik 2 mm. en batman laser 30nJ ti ganny servi pou eksit sa lesantiyon a 540 nm avek en letan retar -10 a 7000 ps. proses sa data set parey in ganny dekrir pour Rps. zantiy pal.
sa manbràn ti ganny pelete par santrifigasyon a 150,000 RCF pou 2 erdtan a 4°C, e apre son absorbans a 880 nm ti ganny resuspend dan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) e 200 mM NaCl. fonn sa manbràn par dousman melanz 2% (w/v) β-DDM pou 1 erdtan dan fernwanr a 4°C. sa lesantiyon ti ganny dilye dan 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) a en konsantrasyon protein 2.5 mg ml-1 (analiz Bio-Rad). Plis prosesis ti ganny fer apartir metod ki ti'n ganny pibliye oparavan (54), komans avek dilye 50 μg protein dan en total 50 μl TEAB ki ti annan 1% (w/v) sodyum laurate (Merck, UK). Apre sonikasyon pour 60 s, i ti ganny redwir avek 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) a 37°C pour 30 minit. Pour S-alkylation, enkile sa lesantiyon avek 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) e azout li dan en solisyon stok isopropanol 200 mM pour 10 minit a tanperatir lasanm. Dizesyon proteolitik ti ganny fer par azout 2 μg melanz trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) e enkile a 37°C pour 3 erdtan. sirfaktan laurate ti ganny tire par azout 50 μl ethyl acetate ek 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) e vortexing pour 60 s. separasyon faz ti ganny promouvwar par santrifigasyon a 15,700 RCF pou 5 minit. dapre protokol fabrikan, en kolonn C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ti ganny servi pou aspire e desel avek swen faz pli ba ki ti annan sa peptid. Apre ki in sek par santrifigasyon dan vid, sa lesantiyon ti ganny fonn dan 0.5% TFA ek 3% asetonitril, e 500 ng ti ganny analize par kromatografi nanoflow RP kouple avek spektrometri mas an servan bann paramet sistenm ki ti ganny detaye oparavan.
servi MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pou idantifikasyon protein e kantite pou rod Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Lenformasyon proteomik spektrometri mas in ganny depoze dan ProteomeXchange Alliance atraver repozitwar partener PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) anba idantifikasyon dataset PXD020402.
Pour analiz par RPLC kouple avek spektrometri mas ionizasyon electrospray, konpleks RC-LH1 ti ganny prepare apartir Rps sovaz. An servan metod ki ti'n ganny pibliye oparavan (16), konsantrasyon protein ki ti ganny prodwi dan bann selil palustris ti 2 mg ml-1 dan 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl e 0.03% (w/v) β- (analiz Bio-Rad) ) DDM. dapre protokol fabrikan, servi 2D purification kit (GE Healthcare, USA) pou tir 10 μg protein par metod presipitasyon, e fonn presipitasyon dan 20 μl 60% (v / v) asid formik (FA), 20% (v / v) Acetonitrile e 20% (v/v) delo. senk mikrolit ti ganny analize par RPLC (Dionex RSLC) kouple avek spektrometri mas (Maxis UHR-TOF, Bruker). servi kolonn MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) pou separasyon a 60°C e 100μlmin -1, avek en gradient 85% (v / v) solvan A [0.1% (v / v) FA e 0.02% (V/v) TFA solisyon akeuz] avek solvan 85% (v / v) [0.1%(v/v) FA e 0.02%(v/v) dan 90%(v/v) acetonitrile TFA] An servan sours ionizasyon electrospray standar e bann paramet par defo pou plis ki 60 minit, spektrometr mas i ganny 100 a 2750 m/z (mas-to-charge ratio). Avek led zouti portal resours bioenformatik ExPASy FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), map spektak mas avek bann sou-yinite sa konpleks.
bann selil ti ganny grandi pou 72 erdtan anba 100 ml NF-ba (10μMm-2 s-1), mwayen (30μMm-2 s-1) oubyen o (300μMm-2 s-1) lalimyer. M22 medyom (M22 medyom dan lekel ammonium sulfate i ganny omet e sodyum succinate i ganny ranplase par sodium acetate) dan en boutey 100 ml screw-top (23). dan senk sikl 30-s, bann perl an ver 0.1 mikron ti ganny perle a en rapor volim 1:1 pou lyse bann selil e refwadi lo ice pou 5 minit. sa materyo ensolib, bann selil ki pa'n kase e bann perl an ver ti ganny retire par santrifigasyon a 16,000 RCF pou 10 minit dan en mikrosantrifiz lo ban. sa manbràn ti ganny separe dan en rotor Ti 70.1 avek 100,000 RCF dan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) avek en 40/15% (w/w) gradient sikros pou 10 erdtan.
parey in ganny dekrir dan nou travay presedan, iminodeteksyon sa tag His lo PufW (16). an bref, sa konpleks nwayo pirifye (11.8 nM) oubyen sa manbràn ki konteni menm konsantrasyon RC (determine par oksidasyon ki tir sa spektak diferans redwir e ki match load lo sa gel ki'n ganny kolore) dan 2x SDS loading buffer (Merck, UK) ki'n ganny dilye de fwa. bann protein ti ganny separe lo en replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). En gel ti ganny kolore avek Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) pou load e vizyalize sa sou-unit RC-L. Protein lo dezyenm gel ti ganny transfer dan manbràn polyvinylidene fluoride (PVDF) aktive par methanol (Thermo Fisher Scientific, UK) pou immunoassay. manbràn PVDF ti ganny bloke dan 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 e 5% (w / v) lapoud dile ekreme, e apre enkile avek antikor primer anti-His (dan dilye antikor buffer [50 mM tris-HCl 7.6), 150 mM NaCl ek 0.05% (v/v) Tween-20] dan 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) pou 4 erdtan. Apre lav 3 fwa pour 5 minit dan tampon antikor, sa manbràn ti ganny konbine avek antikor segonder anti-souri (dilye 1:10,000 dan tampon antikor) enkobe pour permet deteksyon (5 minit apre 3 lav dan tampon antikor) an servan WAR EST 20. sibstra chemiluminescence (Cyanagen, Italy) ek Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Par desin distribisyon lentansite sak gel kolore oubyen lane immunoassay, entegre rezyon anba pik e kalkil rapor lentansite RC-L (gel kolore) ek Protein-W (immunoassay), dan ImageJ (57) Prosez zimaz. Sa bann rapor ti ganny konverti an bann rapor moler an prenon kont ki rapor RC-L avek protein-W dan sa lesantiyon pir RC-LH114-W ti 1:1 e normaliz sa set lenformasyon antye an konsekans.
Pour bann materyo siplemanter pour sa lartik, silvouple vwar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Sa i en lartik akse ouver ki ganny distribye anba bann term Creative Commons Attribution License. sa lartik i permet litilizasyon, distribisyon, e reprodiksyon san restriksyon dan nenport ki medyom anba kondisyon ki travay orizinal i ganny byen site.
Not: Nou zis demann ou pou donn ou ladres imel pou ki sa dimoun ki ou rekomande lo sa paz i konnen ki ou anvi zot vwar sa imel e ki i pa spam. nou pa pou kaptir okenn ladres imel.
sa kestyon i ganny servi pou teste si ou en viziter e anpes soumisyon spam otomatik.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Kirma, Christine Hitchier, Andrew Ccoil Hunter.
striktir o rezolisyon sa konpleks latrap lalimyer 1 dan sant reaksyon i donn nouvo apersi dan dinamik quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Kirma, Christine Hitchier, Andrew Ccoil Hunter.
striktir o rezolisyon sa konpleks latrap lalimyer 1 dan sant reaksyon i donn nouvo apersi dan dinamik quinone.
©2021 Lasosyasyon Ameriken pou Lavansman Lasyans. tou drwa rezerve. AAAS i en partener HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ek COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.